李佳榮，李鵬舉，陳海蘭，韋英明，潘 艷

（1.廣西百色農(nóng)業(yè)學(xué)校，廣西 百色 533000；2.廣西大學(xué)，a.動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，南寧 530004；3.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，南寧 530007）

細(xì)菌混合感染引起的出血性腸炎、纖維素性肺炎是養(yǎng)殖山羊中經(jīng)常發(fā)生的疾病。細(xì)菌混合感染的復(fù)雜性使疾病的診斷與預(yù)防頗為棘手。通過實(shí)驗(yàn)室鑒定結(jié)合臨床癥狀綜合分析，才能確定主要導(dǎo)致血性腸炎、纖維素性肺炎的病菌，然后通過藥物篩選進(jìn)行合理治療。大多數(shù)山羊細(xì)菌混合感染與養(yǎng)殖條件及疾病預(yù)防有緊密聯(lián)系，因此，改善養(yǎng)殖環(huán)境、滿足羊群營養(yǎng)需求、加強(qiáng)免疫力才是預(yù)防和控制疾病的有力措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 廣西某隆林山羊養(yǎng)殖場突然病死的山羊，剖解后取出心、肝、脾、肺、腎、十二指腸送至實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.1.2 試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒、100 bp Ladder、2×EsTaqMaster Mix（Dye）、ddH2O均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑盒、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板等均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于檢測綿羊肺炎支原體（MO2）、絲狀支原體山羊亞種（MMMLC2）、多殺性巴氏桿菌A型（PMA）與多殺巴氏桿菌D型（PMD）、溶血曼氏桿菌（MH）、隱秘桿菌（AP）、16S rDNA通用引物。引物如表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 用點(diǎn)燃的酒精棉球在各內(nèi)臟取樣點(diǎn)表層消毒滅菌，選取病變較為明顯的部位剪開，用無菌接種環(huán)蘸取病變組織部位劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板和LB營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h［1］。

1.2.2 細(xì)菌的分離 用平板劃線法挑取單個(gè)菌落，反復(fù)挑取6～8次［2］，革蘭氏染色鏡檢，挑取較為純凈單一的菌種進(jìn)行分子鑒定。

1.2.3 病料DNA/RNA的提取 將肺臟的病變部位剪取小部分，置于無菌研缽中，加入1 mL雙蒸水進(jìn)行研磨，直至組織樣品破碎，然后將研磨好的組織樣品裝入2 mL EP管中，反復(fù)凍融3次，使病菌細(xì)胞破裂，通過DNA/RNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA/RNA［3］，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 單一細(xì)菌DNA/RNA的提取 于1.5 mL離心管中加入0.3 mL雙蒸水，挑取已經(jīng)分離純化的單個(gè)菌落于離心管中，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒中操作步驟提取。

1.2.5 PCR鑒定 參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19915.4—2000，對樣品進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系：2×EsTaqMaster Mix（Dye）25 μL，上、下游引物各2 μL，樣品6 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度參考各引物的退火溫度，見表1），72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 min延伸4 min；4℃保存［4］。取10 μL PCR產(chǎn)物加入到1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察分析。

1.2.6 病菌的K-B藥敏試驗(yàn) 利用無菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于滅菌的生理鹽水中，制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海缓笥脽o菌的棉拭子蘸取菌懸液均勻涂布于血平板上，將藥敏紙片貼在平板內(nèi)，37℃培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌環(huán)的直徑并記錄［5］。

1.2.7 16S rDNA測序結(jié)果分析 由于采用二代測序技術(shù)，每次只能獲取800 bp堿基序列，因此，測序時(shí)將16S區(qū)進(jìn)行分開讀取，即前端加標(biāo)記物、引物和v1～v4區(qū)的片段，而后段采用逆向測序。在比對分析時(shí)要取出前后兩端的標(biāo)記物和引物，連接16S區(qū)，然后在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。

1）16S區(qū)的拼接。在DNAman軟件中Sequence選項(xiàng)下選擇Sequence Assembly，然后Add file添加seq文件的27F前端與1492R后段，之后點(diǎn)擊Assemble，若顯示有重疊區(qū)，則表示可以進(jìn)行拼接，再選擇show result，最后Export在txt文本中備用［6］。而大多數(shù)16S區(qū)經(jīng)過拼接基本上穩(wěn)定在1 410～14 850 bp。結(jié)果中出現(xiàn)雙峰，則表示分離到的細(xì)菌不是單一菌種，需要進(jìn)一步進(jìn)行純化分離，然后繼續(xù)進(jìn)行測序。

2）拼接序列的比對。打開NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST下的nucleotide blast進(jìn)行選擇，然后復(fù)制拼接好的文本文件中的堿基序列于數(shù)據(jù)庫中，同時(shí)以Standard databases數(shù) 據(jù) 庫 和rRNA/ITS databases兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果共同參考，若兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中相同菌種的相似度均>99%，則認(rèn)為測序菌種和比對的菌種為同一菌種；若相似度在98%～99%，則認(rèn)為測序菌種有50%的概率和比對的菌種為同一菌種；若相似度在97%～98%，則認(rèn)為測序菌種有20%的概率和比對的菌種為同一菌種；若相似度在95%～97%，則認(rèn)為測序菌種為新的種；若相似度<95%，則認(rèn)為測序菌種為新的屬，可進(jìn)一步進(jìn)行新的細(xì)菌鑒定［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床病理變化

對內(nèi)臟解剖觀察發(fā)現(xiàn)肺臟出血、尖葉黏連；肝臟出血，有壞死灶；腸道出血，有惡臭味；腎臟有出血斑點(diǎn)；脾臟腫大呈現(xiàn)血黑色。

2.2 細(xì)菌的分離

在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上觀察到深紫黑色、光滑、帶有金屬光澤的圓形菌落。革蘭氏染色鏡檢，呈兩端頓圓、粉紅色桿狀的形態(tài)，結(jié)合臨床癥狀判斷為致病性大腸桿菌［8］。而在血平板培養(yǎng)基和LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上分離到5株純化的細(xì)菌，經(jīng)過16S rDNA鑒定分別為大腸桿菌、多殺巴氏桿菌、印度不動(dòng)桿菌、豚鼠氣單胞菌、科氏葡萄球菌。其中大腸桿菌與伊紅美藍(lán)平板中的鑒定結(jié)果一致，而多殺巴氏桿菌與PCR鑒定結(jié)果一致，這些細(xì)菌均會(huì)導(dǎo)致內(nèi)臟出血而引起動(dòng)物發(fā)病，與臨床癥狀相吻合。

2.3 革蘭氏染色結(jié)果

對分離純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，判定其基本的外形特征，革蘭氏染色結(jié)果如圖1所示。

圖1 5種細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果

2.4 PCR鑒定結(jié)果

對研磨樣品進(jìn)行PCR鑒定，被檢測樣品中只有多殺巴氏桿菌D型出現(xiàn)了657 bp的條帶，其他樣品均無條帶，該羊感染的是多殺性巴氏桿菌D型（表2）。

表2 樣品PCR鑒定結(jié)果

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹

將16S堿基序列經(jīng)過DNAman軟件拼接，再在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，選擇相似度大于97%的菌株16S序列；最后使用MEGA-X軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)過Neighbor-Joining算法對堿基序列進(jìn)行逐一比對，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。當(dāng)待鑒定菌種與相似菌種在同一個(gè)枝干上時(shí)，則表示待鑒定菌種為該菌種，從而確定待鑒定菌種［9］。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖2所示。

圖2 5種細(xì)菌的16S系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選擇22種藥敏試紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。混合細(xì)菌對羅紅霉素、利福平、青霉素、四環(huán)素、林可霉素、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明、阿奇霉素不敏感；對頭孢曲松、阿米卡星、氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢他啶、多粘菌素中度敏感；而對頭孢噻肟、替米考星、卡那霉素、氟苯尼考高度敏感。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.7 防治措施

隔離患病羊只是關(guān)鍵，防止疾病的蔓延，便于精準(zhǔn)化用藥治療。具體治療措施如下：①替米考星注射液0.04 mL/kg，皮下或肌肉注射，每天1次，連用5 d；②青霉素鈉與恩若沙星注射液液混合0.1 mL/kg，肌肉注射，每天2次，連用5 d。2種治療方案交替使用可以防止混合菌產(chǎn)生抗藥性，更有利于殺滅細(xì)菌［10］。

3 討論

3.1 5株分離菌株的鑒定

大腸桿菌廣泛存在消化道內(nèi)，只有少數(shù)為致病性大腸桿菌，因此分子鑒定可以鑒定到亞種水平，再通過臨床特征上山羊腹瀉癥狀，因此確定為致病性大腸桿菌；而通過多殺性巴氏桿菌的特定性引物、16S測序以及多器官有出血及出血點(diǎn)等綜合判斷為多殺性巴氏桿菌［11］；印度不動(dòng)桿菌在血平板上生長時(shí)為乳白色，表面光滑不透明，且容易產(chǎn)生難聞氣味，該菌株廣泛存在于垃圾堆，而臨床剖解中也發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟中產(chǎn)生腐敗的氣味，因此綜合判斷為印度不動(dòng)桿菌［12］；豚鼠氣單胞菌可引起動(dòng)物腹瀉，因此分離出菌株與臨床癥狀相符合［13］；而科氏葡萄球菌菌落不透明、乳白色、菌落表面光滑、兼性厭氧、革蘭氏陽性球菌，血平板培養(yǎng)有溶血環(huán)，易引起體溫升高、炎癥以及敗血癥等，且會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的急性死亡。這也與臨床癥狀相符合，因此綜合判定為科氏葡萄球菌［14］。

3.2 飼料配方的調(diào)整與優(yōu)化

通過對該養(yǎng)殖場飼料檢測，發(fā)現(xiàn)該養(yǎng)殖場中30 kg體重成年育肥公羊的營養(yǎng)不合理，從而導(dǎo)致羊群的營養(yǎng)不均一、未能達(dá)到該階段羊群的需要量，造成免疫力低下，養(yǎng)殖成本居高不下，因此需要重新制定全混合飼料。

4 小結(jié)

高溫高濕容易引起病菌的滋生與蔓延，同時(shí)空氣流動(dòng)性較差，加速傳染性疾病的傳播，因此做好環(huán)境殺菌與羊群抽檢十分必要，可為精準(zhǔn)化治療與防疫提供可靠的依據(jù)，避免盲目用藥，提高養(yǎng)殖效益。同時(shí)改善飼養(yǎng)環(huán)境，隨時(shí)根據(jù)羊群的生長階段改變飼料配方，使羊群營養(yǎng)處于達(dá)標(biāo)水平，從源頭上控制預(yù)防疾病。