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        一例隆林山羊敗血癥的診斷與治療

        2022-12-29 07:31:36李佳榮李鵬舉陳海蘭韋英明
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年20期
        關(guān)鍵詞:革蘭氏氏桿菌菌種

        李佳榮,李鵬舉,陳海蘭,韋英明,潘 艷

        (1.廣西百色農(nóng)業(yè)學(xué)校,廣西 百色 533000;2.廣西大學(xué),a.動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院;b.農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院,南寧 530004;3.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué),南寧 530007)

        細(xì)菌混合感染引起的出血性腸炎、纖維素性肺炎是養(yǎng)殖山羊中經(jīng)常發(fā)生的疾病。細(xì)菌混合感染的復(fù)雜性使疾病的診斷與預(yù)防頗為棘手。通過實(shí)驗(yàn)室鑒定結(jié)合臨床癥狀綜合分析,才能確定主要導(dǎo)致血性腸炎、纖維素性肺炎的病菌,然后通過藥物篩選進(jìn)行合理治療。大多數(shù)山羊細(xì)菌混合感染與養(yǎng)殖條件及疾病預(yù)防有緊密聯(lián)系,因此,改善養(yǎng)殖環(huán)境、滿足羊群營養(yǎng)需求、加強(qiáng)免疫力才是預(yù)防和控制疾病的有力措施。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 病料來源 廣西某隆林山羊養(yǎng)殖場突然病死的山羊,剖解后取出心、肝、脾、肺、腎、十二指腸送至實(shí)驗(yàn)室檢測。

        1.1.2 試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒、100 bp Ladder、2×EsTaqMaster Mix(Dye)、ddH2O均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;革蘭氏染色試劑盒、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板等均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

        1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,用于檢測綿羊肺炎支原體(MO2)、絲狀支原體山羊亞種(MMMLC2)、多殺性巴氏桿菌A型(PMA)與多殺巴氏桿菌D型(PMD)、溶血曼氏桿菌(MH)、隱秘桿菌(AP)、16S rDNA通用引物。引物如表1所示。

        表1 PCR擴(kuò)增引物

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 用點(diǎn)燃的酒精棉球在各內(nèi)臟取樣點(diǎn)表層消毒滅菌,選取病變較為明顯的部位剪開,用無菌接種環(huán)蘸取病變組織部位劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板和LB營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)24 h[1]。

        1.2.2 細(xì)菌的分離 用平板劃線法挑取單個(gè)菌落,反復(fù)挑取6~8次[2],革蘭氏染色鏡檢,挑取較為純凈單一的菌種進(jìn)行分子鑒定。

        1.2.3 病料DNA/RNA的提取 將肺臟的病變部位剪取小部分,置于無菌研缽中,加入1 mL雙蒸水進(jìn)行研磨,直至組織樣品破碎,然后將研磨好的組織樣品裝入2 mL EP管中,反復(fù)凍融3次,使病菌細(xì)胞破裂,通過DNA/RNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA/RNA[3],置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.4 單一細(xì)菌DNA/RNA的提取 于1.5 mL離心管中加入0.3 mL雙蒸水,挑取已經(jīng)分離純化的單個(gè)菌落于離心管中,按照細(xì)菌基因組提取試劑盒中操作步驟提取。

        1.2.5 PCR鑒定 參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19915.4—2000,對樣品進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系:2×EsTaqMaster Mix(Dye)25 μL,上、下游引物各2 μL,樣品6 μL,補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,退火30 s(退火溫度參考各引物的退火溫度,見表1),72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 min延伸4 min;4℃保存[4]。取10 μL PCR產(chǎn)物加入到1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,通過凝膠成像系統(tǒng)觀察分析。

        1.2.6 病菌的K-B藥敏試驗(yàn) 利用無菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于滅菌的生理鹽水中,制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海缓笥脽o菌的棉拭子蘸取菌懸液均勻涂布于血平板上,將藥敏紙片貼在平板內(nèi),37℃培養(yǎng)24 h,觀察并測量抑菌環(huán)的直徑并記錄[5]。

        1.2.7 16S rDNA測序結(jié)果分析 由于采用二代測序技術(shù),每次只能獲取800 bp堿基序列,因此,測序時(shí)將16S區(qū)進(jìn)行分開讀取,即前端加標(biāo)記物、引物和v1~v4區(qū)的片段,而后段采用逆向測序。在比對分析時(shí)要取出前后兩端的標(biāo)記物和引物,連接16S區(qū),然后在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。

        1)16S區(qū)的拼接。在DNAman軟件中Sequence選項(xiàng)下選擇Sequence Assembly,然后Add file添加seq文件的27F前端與1492R后段,之后點(diǎn)擊Assemble,若顯示有重疊區(qū),則表示可以進(jìn)行拼接,再選擇show result,最后Export在txt文本中備用[6]。而大多數(shù)16S區(qū)經(jīng)過拼接基本上穩(wěn)定在1 410~14 850 bp。結(jié)果中出現(xiàn)雙峰,則表示分離到的細(xì)菌不是單一菌種,需要進(jìn)一步進(jìn)行純化分離,然后繼續(xù)進(jìn)行測序。

        2)拼接序列的比對。打開NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST下的nucleotide blast進(jìn)行選擇,然后復(fù)制拼接好的文本文件中的堿基序列于數(shù)據(jù)庫中,同時(shí)以Standard databases數(shù) 據(jù) 庫 和rRNA/ITS databases兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果共同參考,若兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中相同菌種的相似度均>99%,則認(rèn)為測序菌種和比對的菌種為同一菌種;若相似度在98%~99%,則認(rèn)為測序菌種有50%的概率和比對的菌種為同一菌種;若相似度在97%~98%,則認(rèn)為測序菌種有20%的概率和比對的菌種為同一菌種;若相似度在95%~97%,則認(rèn)為測序菌種為新的種;若相似度<95%,則認(rèn)為測序菌種為新的屬,可進(jìn)一步進(jìn)行新的細(xì)菌鑒定[7]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 臨床病理變化

        對內(nèi)臟解剖觀察發(fā)現(xiàn)肺臟出血、尖葉黏連;肝臟出血,有壞死灶;腸道出血,有惡臭味;腎臟有出血斑點(diǎn);脾臟腫大呈現(xiàn)血黑色。

        2.2 細(xì)菌的分離

        在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上觀察到深紫黑色、光滑、帶有金屬光澤的圓形菌落。革蘭氏染色鏡檢,呈兩端頓圓、粉紅色桿狀的形態(tài),結(jié)合臨床癥狀判斷為致病性大腸桿菌[8]。而在血平板培養(yǎng)基和LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上分離到5株純化的細(xì)菌,經(jīng)過16S rDNA鑒定分別為大腸桿菌、多殺巴氏桿菌、印度不動(dòng)桿菌、豚鼠氣單胞菌、科氏葡萄球菌。其中大腸桿菌與伊紅美藍(lán)平板中的鑒定結(jié)果一致,而多殺巴氏桿菌與PCR鑒定結(jié)果一致,這些細(xì)菌均會(huì)導(dǎo)致內(nèi)臟出血而引起動(dòng)物發(fā)病,與臨床癥狀相吻合。

        2.3 革蘭氏染色結(jié)果

        對分離純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色,判定其基本的外形特征,革蘭氏染色結(jié)果如圖1所示。

        圖1 5種細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果

        2.4 PCR鑒定結(jié)果

        對研磨樣品進(jìn)行PCR鑒定,被檢測樣品中只有多殺巴氏桿菌D型出現(xiàn)了657 bp的條帶,其他樣品均無條帶,該羊感染的是多殺性巴氏桿菌D型(表2)。

        表2 樣品PCR鑒定結(jié)果

        2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹

        將16S堿基序列經(jīng)過DNAman軟件拼接,再在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對,選擇相似度大于97%的菌株16S序列;最后使用MEGA-X軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,經(jīng)過Neighbor-Joining算法對堿基序列進(jìn)行逐一比對,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。當(dāng)待鑒定菌種與相似菌種在同一個(gè)枝干上時(shí),則表示待鑒定菌種為該菌種,從而確定待鑒定菌種[9]。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖2所示。

        圖2 5種細(xì)菌的16S系統(tǒng)發(fā)育樹

        2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

        選擇22種藥敏試紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果如表3所示。混合細(xì)菌對羅紅霉素、利福平、青霉素、四環(huán)素、林可霉素、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明、阿奇霉素不敏感;對頭孢曲松、阿米卡星、氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢他啶、多粘菌素中度敏感;而對頭孢噻肟、替米考星、卡那霉素、氟苯尼考高度敏感。

        表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

        2.7 防治措施

        隔離患病羊只是關(guān)鍵,防止疾病的蔓延,便于精準(zhǔn)化用藥治療。具體治療措施如下:①替米考星注射液0.04 mL/kg,皮下或肌肉注射,每天1次,連用5 d;②青霉素鈉與恩若沙星注射液液混合0.1 mL/kg,肌肉注射,每天2次,連用5 d。2種治療方案交替使用可以防止混合菌產(chǎn)生抗藥性,更有利于殺滅細(xì)菌[10]。

        3 討論

        3.1 5株分離菌株的鑒定

        大腸桿菌廣泛存在消化道內(nèi),只有少數(shù)為致病性大腸桿菌,因此分子鑒定可以鑒定到亞種水平,再通過臨床特征上山羊腹瀉癥狀,因此確定為致病性大腸桿菌;而通過多殺性巴氏桿菌的特定性引物、16S測序以及多器官有出血及出血點(diǎn)等綜合判斷為多殺性巴氏桿菌[11];印度不動(dòng)桿菌在血平板上生長時(shí)為乳白色,表面光滑不透明,且容易產(chǎn)生難聞氣味,該菌株廣泛存在于垃圾堆,而臨床剖解中也發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟中產(chǎn)生腐敗的氣味,因此綜合判斷為印度不動(dòng)桿菌[12];豚鼠氣單胞菌可引起動(dòng)物腹瀉,因此分離出菌株與臨床癥狀相符合[13];而科氏葡萄球菌菌落不透明、乳白色、菌落表面光滑、兼性厭氧、革蘭氏陽性球菌,血平板培養(yǎng)有溶血環(huán),易引起體溫升高、炎癥以及敗血癥等,且會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的急性死亡。這也與臨床癥狀相符合,因此綜合判定為科氏葡萄球菌[14]。

        3.2 飼料配方的調(diào)整與優(yōu)化

        通過對該養(yǎng)殖場飼料檢測,發(fā)現(xiàn)該養(yǎng)殖場中30 kg體重成年育肥公羊的營養(yǎng)不合理,從而導(dǎo)致羊群的營養(yǎng)不均一、未能達(dá)到該階段羊群的需要量,造成免疫力低下,養(yǎng)殖成本居高不下,因此需要重新制定全混合飼料。

        4 小結(jié)

        高溫高濕容易引起病菌的滋生與蔓延,同時(shí)空氣流動(dòng)性較差,加速傳染性疾病的傳播,因此做好環(huán)境殺菌與羊群抽檢十分必要,可為精準(zhǔn)化治療與防疫提供可靠的依據(jù),避免盲目用藥,提高養(yǎng)殖效益。同時(shí)改善飼養(yǎng)環(huán)境,隨時(shí)根據(jù)羊群的生長階段改變飼料配方,使羊群營養(yǎng)處于達(dá)標(biāo)水平,從源頭上控制預(yù)防疾病。

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