張金魁 林鵬程 王志波 劉曉翠,3 王 敏,3 馬 敏,3

1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海 西寧 810007；2.天津大學(xué)管理與經(jīng)濟(jì)學(xué)部，天津 300072；3.青海省青藏高原植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007

柳蘭(EpilobiumangustifoliumL.)是柳葉菜科柳蘭屬植物，為常用藏藥材，藏文名“恰班曲孜”，分布于青海、西藏、云南、四川等地區(qū)[1]。全草入藥，味酸，性涼，利尿消腫和清熱利膽功效較好，主治“赤巴”熱、膽囊炎、熱性腹瀉、排尿困難癥及腸道寄生蟲疾病[2-5]。在俄羅斯，柳蘭葉常被用作茶葉的替代品，稱為“卡普茶”或“伊萬茶”，用于治療胃炎、胃潰瘍和睡眠障礙[6-7]，我國(guó)也有柳蘭制茶的報(bào)道。柳蘭主要含酚酸、黃酮和鞣質(zhì)類成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，柳蘭具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。課題組前期研究[10]表明，柳蘭揮發(fā)油提取物對(duì)多種常見致病菌具有顯著的抑制活性，其乙醇提取物對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CDC25A/CDC25B磷酸酶表現(xiàn)出明顯的抑制活性[11]。為明確柳蘭廣泛的藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步開發(fā)利用該藥材資源，課題組對(duì)柳蘭中的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從其95%乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位中分離得到了11個(gè)黃酮類化學(xué)成分。其中，化合物1為首次從柳蘭中分離得到，化合物7、9、10為首次從柳葉菜科植物中分離得到。

1 儀器與材料

硅膠(200-300目)(青島海洋化工)，薄層色譜板(青島海洋化工)，Sephadex LH-20(上海市紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)，MCI樹脂(日本三菱化學(xué)公司)，石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇均為分析純(天津市紅巖化學(xué)試劑廠)，色譜甲醇(山東禹王和天下新材料有限公司)，乙醇為工業(yè)級(jí)試劑，三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，制備型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，Agilent ZORBAX SB-C1821.2 mm×250 mm 7 μm 色譜柱(美國(guó)Agilent公司)，Bruker Avance 500 MHz核磁共振波溥儀(德國(guó)Bruker公司)。

藥材柳蘭于2018年7月(花期)采自青海互助北山林場(chǎng)，由林鵬程教授鑒定為柳葉菜科柳蘭屬植物柳蘭E.angustifoliumL.，植物樣本洗凈陰干，標(biāo)本保存于青海省青藏高原植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本室，標(biāo)本號(hào)為No．MD02312。

2 提取與分離

柳蘭全草粗粉(5.7 kg)經(jīng)50 L 95%乙醇浸泡 7 d，濾過，殘?jiān)?0 L 95%及70%乙醇分別熱回流提取1次，每次90 min，濃縮所有提取液得總浸膏1.208 kg。將用熱水分散提取物后，依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，得到4個(gè)萃取部位A-D。對(duì)乙酸乙酯部位(B)采用正相硅膠柱色譜經(jīng)氯仿-甲醇體系梯度洗脫(40∶1-0∶1，V/V)，合并薄層色譜行為相似的組分合并和得到6個(gè)組分(Fr. A-F)。Fr.C部位采用MCI樹脂柱經(jīng)甲醇-水10%～60%體系梯度洗脫得6個(gè)部位Fr.C1～C6，并將以上部位進(jìn)一步通過反復(fù)柱色譜以及制備色譜分離得到化合物1～5。正丁醇部位干燥浸膏與乙酸乙酯部位大極性部分合并，采用MCI為填料，經(jīng)甲醇-水梯度洗脫(5%～60%)，分離得到5個(gè)洗脫部位Fr.D1～D5，并將以上部位進(jìn)一步通過反復(fù)柱色譜以及制備色譜分離得到化合物6～11。其中，化合物1為首次從柳蘭乙酸乙酯部位中分離得到，化合物7、9、10為首次從柳葉菜科植物中分離得到。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)與文獻(xiàn)匹配，所分離得到的11個(gè)化合物的鑒定數(shù)據(jù)與相關(guān)已報(bào)道化合物基本一致，以下為各化合物的核磁數(shù)據(jù)。

化合物1：槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(quercetin 3-O-β-D-glucuronide)[12]，淡黃色粉末，分子式為C21H18O13，分子量為478，鹽酸-鎂粉反應(yīng)、Molish反應(yīng)都為陽性。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：7.61 (1H,m,H-2′,6′),6.82 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′ ),6.33 (1H,d,J=1.9 Hz,H-8),6.15 (1H,d,J=1.9 Hz,H-6),5.30 (1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),3.29～3.67 (4H,m,H-2″,3″,4″,5″);13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ：179.1 (C-4),172.2 (C-6″),165.9 (C-7),162.9 (C-5),158.9 (C-9),158.3 (C-2),149.8 (C-4′),145.9 (C-3′),135.3 (C-3),123.5 (C-6′),122.8 (C-1′),117.2 (C-5′),116.0 (C-2′),105.5 (C-10),104.2 (C-1″),99.9 (C-6),94.7 (C-8),77.5 (C-3″),77.0 (C-5″),75.3 (C-2″),72.8 (C-4″)。

化合物2：金絲桃苷(槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷)(hyperoside)[13]，淡黃色粉末，分子式為C21H20O12，分子量為464，F(xiàn)eCl3反應(yīng)、Molish反應(yīng)、鹽酸-鎂粉反應(yīng)都為陽性。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ：7.67 (1H,dd,J=8.4,2.4 Hz,H-6′),7.52 (1H,d,J=2.4 Hz,H-2′),6.81 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.40 (1H,d,J=2.4 Hz,H-8 ),6.20 ( 1H,d,J=2.4 Hz,H-6 ),5.38 ( 1H,d,J=9.5 Hz,H-1″ ),3.43～3.66 (3H,m,H-2″,4″,6a″);13C-NMR (100MHz,DMSO-d6)δ：177.5 (C-4),164.1 (C-7),161.2 (C-5),156.3 (C-9),156.2 (C-2),148.5 (C-4′),144.8 (C-3′),133.5 (C-3),122.0 (C-6′),121.1 (C-1′),115.9 (C-5′),115.2 (C-2′),103.9 (C-10),101.8 (C-1″),98.7 (C-6),93.5 (C-8),75.8 (C-5″),73.2 (C-3″),71.2 (C-2″),67.9 (C-4″),60.1 (C-6″)。

化合物3：槲皮苷(槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷)(quercitrin)[14]，淡黃色粉末，分子式為C21H20O11，分子量為448，鹽酸-鎂粉反應(yīng)和Molish反應(yīng)都為陽性。1H-NMR (400MHz,DMSO-d6)δ：12.65 (1H,s,5-OH),10.86 (1H,s,7-OH),9.70 (1H,s,4′-OH),9.33 (1H,s,3′-OH),7.30 (1H,brs,H-2′),7.25 (1H,d,J=8.4 Hz,H-6),6.86 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.39 (1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.20 (1H,d,J=2.4 Hz,H-6),5.25 (1H,s,H-1′);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)：δ177.8 (C-4),164.2 (C-7),161.3 (C-5),157.4 (C-9),156.5 (C-2),148.5 (C-4′),145.2 (C-3′),134.2(C-3),121.2 (C-1′),120.4 (C-6′),115.7 (C-2′),115.5 (C-5′),104.1 (C-10),101.8 (C-1″),98.7 (C-6),93.7 (C-8),71.2 (C-4″),70.6 (C-2″),70.3 (C-3″),70.1 (C-5″),17.6 (C-6″)。

化合物4：木犀草素(luteolin)[15]，淡黃色粉末，分子式為C15H10O6，分子量為286，F(xiàn)eCl3反應(yīng)與Molish反應(yīng)呈陰性，鹽酸-鎂粉反應(yīng)為陽性。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ： 12.98 (1H,s,5-OH),10.83 (1H,s,7-OH),9.92 (1H,s,4′-OH),9.40 (1H,s,3′-OH),7.41 (2H,m,H-2′,6′),6.89 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.68 (1H,s,H-3),6.45 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ：181.6 (C-4),164.1 (C-2),163.9 (C-7),161.5 (C-9),157.3 (C-5),149.7 (C-4′),145.7 (C-3′),121.5 (C-1′),119.0 (C-6′),116.0 (C-5′),113.4 (C-2′),103.7 (C-10),102.9(C-3),98.8 (C-6),93.8 (C-8)。

化合物5：槲皮素(quercetin)[16]，黃色粉末狀。API-ESI-LC-MS m/z：303.1 [M+H]+；分子式為C15H10O7。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ：12.41 (1H,s,OH-5),7.61 (1H,d,J=2.2 Hz,H-2′),7.52 (1H,dd,J=8.5,2.2 Hz,H-6′),6.88 (1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.42 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.18 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6)；13C-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ：147.4 (C-2),136.2 (C-3),176.3 (C-4),161.2(C-5),98.8 (C-6),164.4 (C-7),94.1 (C-8),156.7 (C-9),103.5 (C-10),122.5 (C-1′),115.5 (C-2′),145.5 (C-3′),148.2 (C-4′),116.2 (C-5′),120.8 (C-6′)。

化合物6：阿福豆苷(山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷)(afzelin)[17]，黃綠色粉末；分子式為C21H20O10，分子量為432，鹽酸-鎂粉反應(yīng)、Molish反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)都為陽性。1H-NMR (500MHz,CD3OD)δ：7.77 (2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),6.93 (2H,d,J=8.0 Hz,H-3′,5′),6.37 (1H,s,H-8),6.20 (1H,s,H-6),5.39 (1H,s,H-1″),4.22 (1H,s,H-2″),0.92 (3H,s,H-6″);13C-NMR (125MHz,DMSO-d6)δ：179.6 (C-4),166.4 (C-7),163.2 (C-5),161.6 (C-4′),159.2 (C-2),158.6 (C-9),136.2 (C-3),131.9 (C-2′,6′),122.6 (C-1′),116.5 (C-3′,5′),105.8 (C-10),103.5 (C-1″),100.0 (C-6),94.9 (C-8),73.2 (C-4″),72.1 (C-3″),72.0 (C-2″),71.9 (C-5″),17.7 (C-6″)。

化合物7：山奈酚-3-O-α-L -阿拉伯呋喃糖苷(kaempferol-3-α-L-arabinofuranoside)[18]，淡黃色粉末，分子式為C20H18O10,分子量為418，鹽酸-鎂粉反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)與Molish反應(yīng)都為陽性。1H-NMR (500MHz,CD3OD)δ：7.97 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),6.94 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),6.38 (1H,s,H-8),6.20 (1H,s,H-6),5.49 (1H,s,H-1″);13C-NMR (125MHz,CD3OD)δ：179.7 (C-4),161.7 (C-7),161.6 (C-5),161.6 (C-4′),159.1 (C-2),158.7 (C-9),134.8 (C-3),131.9 (C-2′,6′),122.8 (C-1′),116.5 (C-3′,5′),109.6 (C-1″),105.1 (C-10),100.5 (C-6),95.2 (C-8),88.0 (C-4″),83.3 (C-2″),78.6 (C-3″),62.5 (C-5″)。

化合物8：槲皮素-3-O-α-L -阿拉伯呋喃糖苷(quercetin -3-α-L-arabinofuranoside)[19]，淡黃色粉末。API-ESI-LC-MS m/z：457.1 [M+Na]+。分子式為C20H18O11，分子量為434，鹽酸-鎂粉反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)與Molish反應(yīng)都為陽性。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ：12.64 (s,1H,5-OH),10.87 (s,1H,7-OH),9.72 (s,1H,4′-OH),9.27 (s,1H,3′-OH),7.55 (dd,J=8.4,2.2 Hz,1H,6′-H),7.48 (d,J=2.2 Hz,1H,2′-H),6.85 (d,J=8.4 Hz,1H,5′-H),6.40 (d,J=1.8 Hz,1H,8-H),6.20 (d,J=1.8 Hz,1H,6-H),5.58 (d,J=1.0 Hz,1H,1″-H),3.72 (m,1H,3″-H),3.56 (m,1H,4″-H);13C-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ：177.7 (C-4),164.3 (C-7),161.2 (C-5),156.9 (C-9),156.3 (C-2),148.5 (C-4′),133.4 (C-3),121.7 (C- 6′),115.5 (C-2′),120.9 (C-1′),145.1 (C-3′),115.5 (C-5′),103.9 (C-10),107.8 (C-1″),98.7 (C-6),93.5 (C-8),76.9 (C-3″),85.8 (C-4″),82.1 (C-2″),60.6 (C-5″)。

化合物9：桑色素-3-O-α-L-鼠李糖苷(morin-3-O-α-L-rhamnoside)[20]，黃色粉末，分子式為C21H20O11，分子量為448，鹽酸-鎂粉反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)和Molish反應(yīng)都為陽性。1H-NMR (500MHz,DMSO-d6)δ：12.64 (1H,s,5-OH),10.86 (1H,s,7-OH),9.69 (1H,s,4′-OH),9.32 (1H,s,2′-OH),7.29 (1H,d,J=2.5 Hz,H-3′),7.25 (1H,dd,J=8.5,2.5 Hz,H-5′),6.85 (1H,d,J=8.5 Hz,H-6′),6.38 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.24 (1H,d,J=1.5 Hz,H-1″),0.81 (3H,d,J=6.0 Hz,H-6″);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ：177.7 (C-4),164.2 (C-7),161.3 (C-5),157.3 (C-2),156.4 (C-9),148.4 (C-4′),145.2 (C-2′),134.2 (C-3),121.7 (C-6′),120.7 (C-1′),115.6 (C-3′),115.4 (C-5′),104.1 (C-10),101.8 (C-1″),98.7 (C-6),93.6 (C-8),71.2 (C-4″),70.6 (C-3″),70.3 (C-5″),70.1 (C-2″),17.5 (C-6″)。

化合物10：槲皮素-3-O-α-D-阿拉伯吡喃糖苷(quercetin-3-O-α-D-arabinopyranoside)[21]，黃色無定型粉末，分子式為C20H18O11，分子量為434，鹽酸-鎂粉反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)與Molish反應(yīng)都為陽性。1H-NMR (500MHz,DMSO-d6)δ：12.64 (1H,s,5-OH),7.65 (1H,d,J=8.5 Hz,H-6′),7.51 (1H,d,J=1.5 Hz,H-2′),6.83 (1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.40 (1H,s,H-8),6.20 (1H,s,H-6),5.28 (1H,d,J=10.0 Hz,H-1″);13C-NMR (125MHz,DMSO-d6)δ：177.5 (C-7),164.3 (C-5),161.2 (C-2),156.3 (C-9),148.6 (C-4′),145.0 (C-3′),133.7 (C-3),122.1 (C-6′),120.9 (C-1′),115.7 (C-2′),115.3 (C-5′),103.9 (C-10),101.4 (C-1″),98.7 (C-6),93.5 (C-8),71.6 (C-3″),70.7 (C-2″),66.0 (C-4″),64.2 (C-5″)。

化合物11：蘆丁 (rutin)[22]，淡黃色粉末，分子式為C27H30O16，分子量為610，鹽酸-鎂粉及Molish反應(yīng)為陽性。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ：12.60 (1H,s,5-OH),10.82 (1H,s,7-OH),9.65 (1H,s,4′-OH),9.16 (1H,s,3′-OH),7.53 (1H,m,H-2′,6′),6.84 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.38 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.35 (1H,d,J=7.5 Hz,H-1″),4.38 (1H,brs,H-1″′),0.99 (3H,d,J=6.0,H-6″′);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ：177.3 (C-4),164.0 (C-7),161.2 (C-5),156.6 (C-9),156.4 (C-2),148.4 (C-4′),144.7 (C-3′),133.3 (C-3),121.6 (C-6′),121.2 (C-1′),116.2 (C-5′),115.2 (C-2′),104.0 (C-10),101.2 (C-1″),100.7 (C-1″′),98.6 (C-6),93.6 (C-8),76.4 (C-3″),75.9 (C-5″),74.1 (C-2″),71.8 (C-4″′),70.5 (C-2″′),70.4 (C-4″),70.0 (C-3″′),68.2 (C-5″′),67.0 (C-6″),17.7 (C-6″′)。

4 討論

柳蘭在我國(guó)野生分布廣泛，是一種兼具觀賞性和藥食兩用價(jià)值的植物資源。黃酮類化合物作為柳蘭中重要的一類活性成分具有廣譜的藥理活性，對(duì)其中黃酮類成分進(jìn)行系統(tǒng)的研究十分必要。本研究從柳蘭中分離得到的11種黃酮類成分中，槲皮素具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[23-24]，金絲桃苷具有提高機(jī)體的抗氧化能力和抗疲勞作用[25],槲皮苷能夠提高免疫水平[26]，阿福豆苷具有較好的腫瘤抑制作用[27]，這些藥理研究報(bào)道與藏醫(yī)具有“利尿消腫和清熱利膽”功能，主治“赤巴”熱、膽囊炎等具有一致性，表明柳蘭黃酮類成分是其廣譜藥理活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，深入研究柳蘭黃酮類成分中的有效成分及生物活性，發(fā)掘其更多的藥用價(jià)值，對(duì)保護(hù)開發(fā)柳蘭藥材資源具有重要意義。