蔣 蒨 周 旭 譚茂蘭 林泉松 陳知孜

重慶科瑞制藥(集團)有限公司，重慶 400060

血塞通咀嚼片是由三七總皂苷加適量賦形劑制成的片劑，具有活血祛瘀、通脈活絡的功能。用于腦絡瘀阻、中風偏癱、心脈瘀阻、胸痹心痛；腦血管病后遺癥、冠心病心絞痛等屬上述證候者。

在血塞通咀嚼片質量標準中，三七總皂苷含量的測定方法為紫外分光光度計比色法，其結果存在虛高現象；采用HPLC法，對產品中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1進行了含量測定，但未控制人參皂苷Re和人參皂苷Rd。因此，參考有關資料[1-2]，本文對標準中含量測定項下的紫外分光光度計比色法和UHPLC法進行了研究、優(yōu)化。實驗結果證明，采用的方法科學合理，結果準確、可靠，進一步提高了該產品的質量控制水平。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津UV-2600紫外測定儀，超高效液相色譜儀(Waters Aquity UPLC H-class)，BS124S電子天平(萬分之一，Sartorius)，XS105(十萬分之一，Metter Toledo)。

1.2 材料 對照品人參皂苷Re(批號：110754-201626)、三七總皂苷(批號：110870-201603)購于中國食品藥品檢定研究院。血塞通咀嚼片[重慶科瑞制藥(集團)有限公司，批號：171201、171202、171203]。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，正丁醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 三七總皂苷的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每 1 mL 含0.32 mg的溶液，即得。

2.1.2 標準曲線的制備 精密吸取對照品溶液 3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述系列對照品溶液2 mL，分別置10 mL試管中，在水浴上蒸干，冷卻至室溫，加5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，加高氯酸0.8 mL，在70 ℃水浴中顯色 15 min，放冷，精密加入冰醋酸5 mL，搖勻，以相應的試劑為空白。照紫外-可見分光光度法，在550 nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程A=10.3699C+0.0002(r=0.9997)。在0.0941～0.2197 mg/mL濃度范圍內，人參皂苷Re的濃度與紫外吸收值線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品適量(約相當于含三七總皂苷50 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加正丁醇，超聲處理30 min，放冷，用正丁醇定容至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液 4 mL，置蒸發(fā)皿中，揮干，加甲醇溶解，轉移置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.4 測定法精密量 取供試品溶液2 mL，置10 mL試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“在水浴上蒸干”起，依照測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中人參皂苷Re的濃度，計算，即得。

2.1.5 專屬性試驗 取輔料適量，按供試品溶液制備方法項下操作，由實驗結果可得，在550 nm處，輔料對制劑含量的影響小于2%，可判定為不干擾血塞通咀嚼片三七總皂苷的含量檢測。

2.1.6 精密度試驗 取對照品6份，按對照品溶液制備方法項下操作，吸光度的RSD=0.77%(n=6)，該方法精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 取供試品供6份(171202批)，按供試品溶液制備方法項下操作，平均含量為50.35 mg/片，RSD=0.98%(n=6)，該方法重復性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液,于不同時間間隔取出，測定吸光度，供試品溶液在 4 h 內穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收試驗 取約相當于含三七總皂苷 25 mg 的供試品共6份，精密稱定，精密加入的人參皂苷Re對照品25 mg，按供試品溶液制備方法項下操作，由實驗結果可的，血塞通咀嚼片三七總皂苷的回收率在95.0%～103.0%之間，RSD=2.14%(n=6)，該方法具有較好的回收率，準確度良好。

2.1.10 樣品測定 取3批樣品，按上述方法檢測。結果見表1。

表1 樣品測定結果

2.2 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及人參皂苷Rd的測定

2.2.1 色譜條件 采用UHPLC法進行含量測定，色譜柱為Infinity Lab 120EC-C18(2.7 μm，4.6 mm×100 mm)，柱溫為25 ℃，流動相為乙腈(A)和水(B)，梯度洗脫(0～6 min，21%A；6～13.5 min，21%A→46%A；13.5～16.5 min，46%A→55%A；16.05～18 min，55%A)，流速為1.5 mL，檢測波長為203 nm，進樣量為10 μL。在上述色譜條件下，對照品、樣品色譜圖如圖1所示。

1：三七皂苷R1；2：人參皂苷Rg1；3：人參皂苷Re；4：人參皂苷Rb1；5：人參皂苷Rd圖1 專屬性試驗液相色譜圖

2.2.2 溶液的制備 取三七總皂苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含2.5 mg的溶液，即得對照品溶液。取重量差異項下的本品，研細，精密稱取適量(約相當于含三七總皂苷62.5 mg)，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)40 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 專屬性試驗 取血塞通咀嚼片空白混合輔料(按處方配比)適量，按供試品溶液制備方法處理。精密量取供試品溶液、空白輔料溶液和對照溶液各10 μL，照上述色譜條件測定，由圖1可知，空白輔料溶液峰在主峰位置無吸收峰，空白輔料對含量測定無干擾，供試品溶液中5種成分人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Re及人參皂苷Rd的保留時間與對照品溶液中5種成分的保留時間一致。

2.2.4 精密度試驗 取對照溶液10 μL，照上述色譜條件測定，連續(xù)進樣 6 次。測得人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Re及人參皂苷Rd 峰面積的RSD分別為0.13%、0.18%、 0.14%、0.70%和0.08%，表明儀器進樣精密度良好。

2.2.5 線性關系考察 取三七總皂苷對照品適量，制備相當于供試品溶液濃度20%、60%、100%、140%、180%的線性溶液。照上述色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積相對濃度進行線性回歸計算，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Re及人參皂苷Rd的回歸方程分別為：A=1658.7758C+9832.2500(r=0.9999)，A=2270.0437C-7360.4500(r=0.9999)，A=1747.7460C-1962.0000(r=0.9999)，A=2110.2390C-3142.4000(r=0.9997)，A=1841.9932C-916.3000，r=0.9999。結果表明，人參皂苷Rb1在139.8296～1258.4664 μg/mL，人參皂苷Rg1在1132.7624～1194.8616 μg/mL、三七皂苷R1在37.3552～336.1968 μg/mL、人參皂苷Re在18.6776～168.0984 μg/mL及人參皂苷Rd在38.3648～345.2832 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一批供試品(171202批)，按“2.2.2溶液的制備”項下方法，制備相當于供試品溶液濃度80%、100%和120%的樣品溶液各3份，照上述色譜條件測定，9份樣品溶液中人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd以及總皂苷平均含量分別為15.45%、15.76%、4.74%、2.11%、4.26%以及42.33%，RSD%分別為0.31%、0.24%、0.29%、0.34%、0.74%以及0.29%，該方法的重復性良好。

2.2.7 加樣回收試驗 取重量差異項下的本品，研細，精密稱取適量(約相當于含三七總皂苷31 mg)，置具塞錐形瓶中，精密稱取三七總皂苷原料藥(批號：170702)適量至同一具塞錐形瓶中，配制相當于供試品濃度80%、100%與120%的樣品，各濃度平行制備3份，按“2.2.2溶液的制備”項下方法制備樣品溶液，照上述色譜條件測定，并分別計算回收率，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd以及總皂苷平均回收率分別為97.2%、98.0%、97.5%、98.4%、98.2%以及97.7%，RSD%分別為0.40%、0.20%、0.16%、0.44%、0.19%以及0.24%，該方法的重復性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，在室溫放置，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h照上述色譜條件測定，由試驗結果可得，供試品溶液中各成分RSD均小于2%，表明供試品溶液中各成分在室溫條件下12 h內均穩(wěn)定。

2.2.9 樣品測定 取3批樣品，按“2.2.2溶液的制備”項下方法制備樣品溶液，照上述色譜條件測定。結果見表2。

表2 樣品測定結果

3 討論

3.1 對照品的選擇 三七總皂苷是由一系列四環(huán)三萜類衍生物組成，為一個多組分的復雜體系。其含量檢測的原理主要是利用三七總皂苷分子上的糖基能被濃硫酸氧化脫水成糠醛衍生物，從而與香草醛發(fā)生顯色反應。血塞通咀嚼片中三七總皂苷含量測定方法中原對照品為 “三七總皂苷對照品”，由于三七總皂苷為混合物，其成分組成、含量比例的不一致造成血塞通咀嚼片中三七總皂苷檢測含量偏高，而選取其中的主要成分人參皂苷 Re作為檢測指標，檢測結果更接近理論含量，且成本更低，更易獲取，同時根據實驗結果可知，采用人參皂苷 Re為對照品更合理，可行性更高。

3.2 提取溶劑的選擇 在血塞通系列制劑中[3]，供試品的提取溶液一般采用乙醇、甲醇，而血塞通咀嚼片中所用的輔料可能會被乙醇、甲醇提取，與顯色劑發(fā)生反應，從而對含量結果造成影響；根據相關資料[4]，三七總皂苷能在正丁醇中溶解，而血塞通咀嚼片所用輔料難溶于正丁醇，如果采用該溶劑，可能在保證完全提取三七總皂苷的前提下，排除輔料對含量測定結果的影響。

在血塞通咀嚼片的原質量標準中，主要對人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1三種主要成分采用HPLC方法進行了含量測定；而在中國藥典2020年版一部收載的三七總皂苷質量標準中對三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 5種成分進行了檢測。因此，筆者增加了人參皂苷Re和人參皂苷Rd的含量測定，將原測定3種主要成分增加為測定5種，同時由于藥典中HPLC方法運行時間較長，試驗對液相色譜方法進行了修改，采用超高效液相色譜法，對色譜柱和流動相比例進行了優(yōu)化篩選，在保證準確測定5個主要成分的前提下，使樣品的檢測時間由1 h縮短為30 min，提高了工作效率的同時，降低了檢測成本和環(huán)境污染。