王俊麗 劉喜平 崔樹婷 景 明 施麗娟 朱中博 武妍琳 馬 泉

1.西寧聯(lián)勤保障中心藥品儀器監(jiān)督檢驗(yàn)站，青海 西寧 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)/甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州市婦幼保健院，甘肅 蘭州 730030；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種以彌散性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂并最終發(fā)展為肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病[1]。目前抗肺纖維化的藥物吡非尼酮和尼達(dá)尼布已獲批上市，但藥物只能夠部分延緩肺纖維化患者肺功能的下降[2]。肺纖維化的病理機(jī)制較為復(fù)雜，單一靶點(diǎn)的藥物無法改善或逆轉(zhuǎn)肺纖維化的進(jìn)程，目前仍缺乏被廣泛認(rèn)可的有效藥物。探尋針對(duì)不同部位、不同靶點(diǎn)等多元化藥物的篩選成為研究的重要趨勢(shì)[3-4]。中草藥的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑等特征成為抗肺纖維化藥物篩選的重要來源，其在改善肺功能及肺纖維化癥狀、提高生活質(zhì)量等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[5]。

濕生扁蕾是龍膽科扁蕾屬植物濕生扁蕾Gentianopsispaludosa(Hook.f.)Ma(GPM)的干燥全草，具有清熱解毒、鎮(zhèn)咳止痛、健脾止瀉等功效[6]，藏醫(yī)除用于肝炎、腸炎腹瀉外，也常用于流感、咳喘等呼吸系統(tǒng)疾病[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)濕生扁蕾在抗纖維化方面具有優(yōu)勢(shì)[8]。并且發(fā)現(xiàn)濕生扁蕾所含化合物具有潛在的抗肺纖維化活性[9]，但其有效部位及藥理活性并不明確。本研究通過提取濕生扁蕾水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚等不同極性溶劑的有效部位，觀察了這些不同極性溶劑提取部位對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺功能及血?dú)獾挠绊懀云跒樯钊胙芯繚裆饫倏狗卫w維化的有效部位及藥理活性奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器 本研究所用主要儀器有EV351旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀-真空泵(萊伯泰科有限公司)；SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；PN 000A3747氣管插管工具盒(美國(guó)Braintree Scientific Inc公司)，PLT-ANS-MS小動(dòng)物肺功能測(cè)試系統(tǒng)(美國(guó)EMKA科技有限公司)，GEM3500血?dú)夥治鰞x(美國(guó)沃芬Instrumentation Laboratory)；L-600臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 主要藥品與試劑 濕生扁蕾藥材采自甘肅省臨潭縣冶力關(guān)鎮(zhèn)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)景明教授鑒定為龍膽科扁蕾屬植物濕生扁蕾Gentianopsispaludosa(Hook.f.)Ma(GPM)的干燥全草。鹽酸博來霉素(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)2141026)，吡非尼酮膠囊(北京康蒂尼藥業(yè)有限公司，批號(hào)H20133376)，石油醚分析純、正丁醇分析純及乙酸乙酯分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)分別為20170522 、20170328、20170215)，蘇木素伊紅染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G1120)，Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G1340)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠64只，體質(zhì)量(180±20)g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(甘)2015-0002-0001382。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度20%～30%，12 h/12 h晝夜交替環(huán)境，每天給予高壓滅菌墊料及滅菌飲用水，自由攝食飲水。

2 方法

2.1 濕生扁蕾不同提取部位的制備 分別精密稱取濕生扁蕾藥材粉末500 g，分別加20倍量的純水、95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚浸泡24 h，加熱煮沸后進(jìn)行回流提取1次，每次提取時(shí)間3 h，提取液靜置過夜后去渣沉淀，最終獲得水提物84.576 g、乙醇提取部位77.794 g、乙酸乙酯提取部位27.874 g、正丁醇提取部位58.297 g、石油醚提取部位8.296 g。分別密封低溫保存，備用。各提取部位在給藥前用純水溶解，超聲處理10 min使之充分混懸，再用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成混懸液，生藥濃度分別為1.67 g/mL、2.50 g/mL、1.67 g/mL、1.00 g/mL、0.83 g/mL。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 64只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和空白組。參考文獻(xiàn)[10]方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠采用一次性硫酸博來霉素(5 mg/kg)氣管內(nèi)注射誘導(dǎo)建立肺纖維化大鼠模型。待造模成功后，再將實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為7組，每組8只，分別為模型組、吡非尼酮組、Ⅰ組(水提部位組)、Ⅱ組(95%乙醇提取部位組)、Ⅲ組(乙酸乙酯提取部位組)、Ⅳ組(正丁醇提取部位組)、Ⅴ組(石油醚提取部位組)。模型建立成功后第2天開始，參照人與大鼠體表系數(shù)折算，按含濕生扁蕾生藥量4.2 g/kg-1灌胃給藥[11]，給藥體積均為5 mL/kg，空白組、模型組大鼠分別每日給予等量生理鹽水灌胃；吡非尼酮組大鼠每天按0.108 g/kg吡非尼酮(臨床成人推薦維持劑量為1200 mg/d)灌胃，1次/d，連續(xù)21 d。

2.3 大鼠肺功能測(cè)定 各組大鼠28 d后，按設(shè)備提供說明書調(diào)試儀器確認(rèn)系統(tǒng)正常運(yùn)行。選擇用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉狀態(tài)下無創(chuàng)肺功能測(cè)定，待大鼠進(jìn)入深麻醉狀態(tài)即動(dòng)物全身肌肉松弛、呼吸平順、角膜反射消失，行氣管插管，將氣管插管后的大鼠仰臥位置于體描箱，將氣管插管與體描箱氣路通道相連。打開計(jì)算機(jī)iox采集系統(tǒng)軟件，按照大鼠分組及編號(hào)設(shè)置數(shù)據(jù)儲(chǔ)存路徑，觀察氣道壓力曲線、氣道阻力曲線、肺容量曲線變化與動(dòng)物呼吸機(jī)同步且平滑對(duì)稱，待曲線穩(wěn)定后，設(shè)定每10 s生成一組呼吸波數(shù)據(jù)，采集5組數(shù)據(jù)。

2.4 大鼠血?dú)夥治鰷y(cè)定 肺功能檢測(cè)完畢后，腹腔注射10%水合氯醛加深麻醉大鼠后，沿前大鼠腹部正中線備皮消毒至下腹部，并用手術(shù)剪沿腹部正中線依次剪開皮層、肌層、腹膜，組織鑷將腹壁左右兩側(cè)拉開充分暴露大鼠腹腔內(nèi)部，分離腹主動(dòng)脈血。用一次性采血針針向近心端1～3 mm處方向刺入腹主動(dòng)脈，另一端插入肝素抗凝管中收集血液。將測(cè)試包內(nèi)置于血?dú)夥治鰞x中，調(diào)試血?dú)夥治鰞x運(yùn)轉(zhuǎn)正常，設(shè)置溫度為37.0 ℃，設(shè)置參數(shù)O2(L/min)為1、FiO2%為2后檢測(cè)各組大鼠血?dú)庵怠?/p>

2.5 大鼠臟器系數(shù)觀察 肺功能檢測(cè)完畢及血液標(biāo)本采集后，脫頸處死大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只，打開腹腔取出脾臟，剔除脂肪組織及系膜；剪開胸腔，小心分離取出肺組織并剔除肺外氣管，生理鹽水沖洗表面血漬，吸水紙小心吸干臟器表面溶液，精密電子天平對(duì)臟器稱重并記錄。參考文獻(xiàn)[12]方法計(jì)算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/動(dòng)物體質(zhì)量(g)×100%。

3 結(jié)果

3.1 濕生扁蕾不同提取部位對(duì)肺纖維化大鼠臟器系數(shù)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺系數(shù)及脾系數(shù)明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，吡非尼酮組及濕生扁蕾不同極性溶劑提取部位組肺系數(shù)、脾系數(shù)均有一定下降，其中以濕生扁蕾乙醇部位組肺系數(shù)下降最為明顯(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠臟器質(zhì)量與臟器系數(shù)

3.2 濕生扁蕾不同提取部位對(duì)肺纖維化大鼠肺功能的影響 與空白組比較，模型組TV、EV、MV、PIF、PEF均顯著降低，f顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，吡非尼酮組及濕生扁蕾水提部位、乙醇部位組、正丁醇部位組、石油醚部位組中的TV、EV、MV、PIF、PEF均顯著升高(P<0.05)，濕生扁蕾乙酸乙酯部位組中的PEF升高(P<0.05)，濕生扁蕾水提部位、乙醇部位組、乙酸乙酯部位組、石油醚部位組中的f顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肺功能的變化

3.3 濕生扁蕾不同提取部位對(duì)肺纖維化大鼠小氣道功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠TI、TE、RT、Penh均顯著升高(P<0.01)，EF50、Cdyn均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，吡非尼酮組及濕生扁蕾各組中TI、TE、RT、Penh均呈不同程度降低，Cdyn呈不同程度升高，其中以濕生扁蕾水提部位、乙醇部位組、正丁醇部位組中的TI及Cdyn顯著升高(P<0.01或P<0.05)，濕生扁蕾各組中TE顯著升高(P<0.01)，濕生扁蕾水提部位、乙醇部位組、正丁醇部位組、石油醚部位組中RT顯著升高(P<0.05)；濕生扁蕾水提部位、乙醇部位組、石油醚部位組Penh均降低(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠小氣道功能的變化

表4 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)獾淖兓?

4 討論

藏藥濕生扁蕾味苦、性寒，具有清熱解毒、鎮(zhèn)咳止痛等功效，常應(yīng)用于肝炎、肝硬化、膽囊炎、潰瘍性結(jié)腸炎等消化系統(tǒng)疾病的治療。此外，民間也用于感冒發(fā)熱、流感、肺炎、急性咽喉炎、扁桃體炎等呼吸系統(tǒng)疾病?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[13-14]顯示，濕生扁蕾不僅能夠抗腸纖維化，其所含黃酮類、有機(jī)酸等化合物亦具有抗肺纖維化活性作用，研究發(fā)現(xiàn)濕生扁蕾中含有的三萜類化合物熊果酸、齊墩果酸能夠降低SiO2誘導(dǎo)的矽肺纖維化模型大鼠TNF-α含量及膠原聚集，減緩大鼠矽肺纖維化的發(fā)展。濕生扁蕾中黃酮類化合物木犀草素對(duì)肺纖維化也有顯著改善作用[15]。然而，濕生扁蕾抗纖維化的活性部位并不明確。

本研究采用純水、95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚不同極性溶劑對(duì)濕生扁蕾進(jìn)行提取，獲得濕生扁蕾不同極性提取部位，建立博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型，表明濕生扁蕾不同極性提取部位均可增加大鼠體重、降低大鼠肺系數(shù)，其中以95%乙醇提取部位最為顯著，提示濕生扁蕾95%乙醇提取部位能減少因肺組織炎性滲出、纖維增生及膠原纖維沉積導(dǎo)致的肺質(zhì)量增加。

肺功能是評(píng)估肺纖維化及臨床療效的重要指標(biāo)[16]。TV、EV反應(yīng)肺容積，PIF、PEF、MV反應(yīng)通氣功能，當(dāng)大鼠肺部纖維化時(shí)，小氣道內(nèi)嗜酸性黏液分泌多，阻礙氣道通暢，引起通氣換氣功能障礙[17]。本實(shí)驗(yàn)肺功能研究結(jié)果顯示，模型組大鼠TV、EV、MV、PIF、PEF均明顯降低，符合肺纖維化大鼠肺功能改變。經(jīng)濕生扁蕾不同極性提取部位干預(yù)后TV、EV、MV、PIF、PEF指標(biāo)均呈不同程度提高。綜合評(píng)判，以95%乙醇提取部位在改善肺纖維化大鼠肺功能方面最為顯著。

RT、TI、TE、EF50、Cdyn、Penh是反應(yīng)小氣道功能的主要指標(biāo)，其中RT、TI、TE取決于呼吸系統(tǒng)的順應(yīng)性及氣道阻力，EF50%反應(yīng)小氣道阻塞程度，Cdyn、Penh受氣道阻力的影響，反應(yīng)肺組織彈性狀況。當(dāng)肺纖維化時(shí)，肺泡上皮損傷導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)損傷塌陷，纖維細(xì)胞增生，肺彈性回縮力降低，肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性出現(xiàn)降低，Penh與BLM誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺功能有高度相關(guān)性[18]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組TI、TE、RT、Penh均升高，EF50、Cdyn均降低，提示小氣道功能障礙、順應(yīng)性降低。濕生扁蕾各提取部位組TI、TE、RT、Penh呈不同程度降低，Cdyn呈不同程度升高，其中以濕生扁蕾95%乙醇提取部位改善效果最佳。而其中f與EF50指標(biāo)變化不明顯，可能與麻醉狀態(tài)下大鼠呼吸肌、膈肌等功能處于松弛狀態(tài)有關(guān)。

課題組前期對(duì)于濕生扁蕾抗纖維化的相關(guān)研究[22]顯示，濕生扁蕾乙醇提取部位能明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎引起的結(jié)腸纖維化，通過高效液相色譜法(HPLC)對(duì)濕生扁蕾乙醇提取物的血清藥物化學(xué)成分研究顯示，其中所含當(dāng)藥黃素、當(dāng)藥醇苷和木犀草素等通過抗炎、抗氧化而具有一定的抗纖維化作用[23]。本研究表明，濕生扁蕾不同極性部位提取部位均能改善博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺功能，而在血?dú)夥治龇矫嬉砸掖继崛〔课蛔顬轱@著，推測(cè)乙醇提取部位可能是濕生扁蕾抗纖維化的有效部位，但是具體活性成分及其相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。