朱海燕 莊田畋 楊 欣 危 英* 李 星 陳 梅 夏 文 周 英

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州百靈制藥股份有限責(zé)任公司，貴陽 安順 550001

復(fù)方一枝黃花噴霧劑由一枝黃花、貫眾、山銀花、連翹、荊芥、艾納香、薄荷制成的噴霧劑[1]。由貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司生產(chǎn)，主要功效為清熱解毒，宣散風(fēng)熱，清利咽喉。用于上呼吸道感染，急、慢性咽炎，口舌生瘡，牙齦腫痛，口臭[2]。已有文獻[3-5]報道一枝黃花、山銀花、貫眾、連翹等中藥具有抗病毒的作用。但是復(fù)方一枝黃花噴霧劑對HIV-1蛋白酶和Cathepsin L蛋白酶活性的影響尚未研究。目前，在藥物研發(fā)的過程中，很多中藥及復(fù)方的活性化合物的篩選依靠分子對接完成，優(yōu)化的小分子與蛋白通過計算機模擬打分，快速有效地發(fā)現(xiàn)小分子活性成分[6]。分子對接技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到很多領(lǐng)域，得到的結(jié)果較為理想[7]。因此本研究采用藥物分子設(shè)計模擬 SYBYL 2.1.1 軟件的Surflex-Dock和模塊完成復(fù)方一枝黃花噴霧劑藥效物質(zhì)與HIV-1蛋白酶和Cathepsin L蛋白酶的分子對接分析，為發(fā)現(xiàn)及開發(fā)抗病毒藥物提供理論依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)庫及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/.tcmspsearch)；SwissADME(http://www.swissadme.ch/)；蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB (http://www. rcsb. org/pdb )；SYBYL 2.1.1(Tripos)處理器為Inter(R) Core(TM) i5-7500 CPU@3.4GHz，64位操作系統(tǒng)，軟件已授權(quán)。

2 實驗方法

2.1 復(fù)方一枝黃花噴霧劑活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)相關(guān)指標(biāo)[8]：口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)、分子量(Molecular Weight ,MW)、類藥性(Drug Likeness,DL)篩選丹參化學(xué)成分，OB通過OBioavail模型對進行預(yù)測，DL通過Tanimoto 系數(shù)通過藥物之間的Tanimoto進行計算。一般認為OB大的化學(xué)成分具有好的口服生物利用度，DL≥0.18 的分子具有較好的類藥性?；谥兴幭到y(tǒng)TCMSP在Herb name中進行查找復(fù)方一枝黃花噴霧劑的化學(xué)成分。相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：OB≥40%，DL≥0.18，MW≤500，保存為mol2 格式。

2.2 復(fù)方一枝黃花噴霧劑小分子能量優(yōu)化 復(fù)方一枝黃花噴霧劑基于Tripos力場對小分子配體進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，獲得合理構(gòu)象。點擊File > Import File，F(xiàn)iles of type選molecule，在Directory選擇小分子所在的文件位置，然后在Selection 列表中點擊需導(dǎo)入的分子；設(shè)置Force Field為Tripos，Charges為Gasteiger-Huckel電荷；設(shè)置最大重復(fù)次數(shù)(Max. Iterations)為10000；設(shè)置Gradient為0.005；設(shè)置Color Option為Force。

2.3 分子對接 采用藥物分子設(shè)計模擬 SYBYL 2.1.1 軟件的Surflex-Dock模塊完成分子對接研究。從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 獲取HIV-1蛋白酶(PDB ID:1QBS)和Cathepsin L蛋白酶(PDB ID:3OF9)。建立存放需要對接的蛋白和小分子的文件夾，Surflex-dock使用原型分子(即protomol)來表示蛋白結(jié)合口袋，本研究基于原配體小分子確定活性口袋。對接模式選擇標(biāo)準(zhǔn)對接。對接完成后，一個分子會產(chǎn)生很多種構(gòu)象。軟件默認是按Total_Score打分值進行排序[9]。

2.4 化合物與靶標(biāo)蛋白相互作用分析 Ligplot作為經(jīng)典的配體與蛋白二維相互作用作圖軟件，應(yīng)用較廣泛，氫鍵和疏水作用基于HBPLUS程序計算，以2D的形式展示結(jié)構(gòu)，方便觀察。本研究基于Ligplot1.4.5版本，小分子與蛋白Merg為PDB格式保存，導(dǎo)入Ligplot軟件中，可以研究多個配體在同一個受體中的結(jié)合、單個配體與不同受體的結(jié)合或者不同配體在不同受體中的結(jié)合，并自動計算形成的氫鍵、疏水作用和結(jié)構(gòu)比對[10]。

2.5 關(guān)鍵化學(xué)成分的ADME/T性質(zhì) 基于SwissADME和TCMSP進行初期藥物開發(fā)毒性篩選。相關(guān)參數(shù)包括有溶解度，血腦屏障穿透性，氫鍵受體數(shù)(H-bond acceptors，HBA)，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù) (rotatable bonds，RBN)，血屏障穿透性 (blood-brain barrier，BBB)，氫鍵供體數(shù) (H-bonddonors，HBD)，Caco-2 細胞通透性 (Caco-2 cell permeabilic)等。

3 實驗結(jié)果

3.1 復(fù)方一枝黃花噴霧劑活性成分 基于TCMSP和文獻篩選出復(fù)方一枝黃花噴霧劑活性成分，其中一枝黃花11個化學(xué)成分，貫眾7個化學(xué)成分，薄荷10個化學(xué)成分，荊芥11個，連翹23個化學(xué)成分，山銀花6個化學(xué)成分，艾納香6個化學(xué)成分。共收集復(fù)方一枝黃花噴霧劑活性成分74個。

3.2 分子對接分析

3.2.1 復(fù)方一枝黃花噴霧劑化合物與HIV-1蛋白酶分子對接分析 目前FDA上市的抗HIV-1蛋白酶抑制劑已達10個，包括：Saquinavir(沙奎那韋，SQV)、Ritonavir(利托那韋，RTV)、Indinavir(茚地那韋，IDV)等。本研究將選擇SQV和RTV為陽性對照藥。SQV和RTV與HIV-1蛋白酶對接得分為7.1和11.8(T_Score)。根據(jù)陽性藥對接結(jié)果，本研究選擇T_Score>7為閾值，復(fù)方一枝黃花噴霧劑74個活性成分，其中26個活性成分與HIV-1蛋白酶結(jié)合得分大于7(表1)。其中化學(xué)成分Diosmetin和Harmonyl與HIV-1蛋白酶結(jié)合的最好。

表1 復(fù)方一枝黃花噴霧劑化合物與HIV-1蛋白酶分子對接分析表

3.2.2 復(fù)方一枝黃花噴霧劑化合物與組織蛋白酶L分子對接分析 SID 26681509 是人組織蛋白酶 L (human cathepsin L) 抑制劑。研究將SID 26681509作為陽性對照，分子對接的結(jié)果顯示，SID 26681509與Cathepsin L 結(jié)合得分為10.4(T_Score)，與SID 26681509對比，尚未發(fā)現(xiàn)復(fù)方一枝黃花噴霧劑的化學(xué)成分與Cathepsin L 結(jié)合得分超過10.4，但是復(fù)方一枝黃花噴霧劑與Cathepsin L結(jié)合T_Score≥7的化學(xué)成分有5個，后面也會重點研究這些化合物的體內(nèi)活性。其中化學(xué)成分2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate和Supraene與組織蛋白酶 L結(jié)合的最好。

表2 復(fù)方一枝黃花噴霧劑化合物與組織蛋白酶 L分子對接分析表

3.3 相互作用分析 化學(xué)成分Diosmetin和Harmonyl與HIV-1蛋白酶結(jié)合的最好，化學(xué)成分2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate和Supraene與組織蛋白酶 L結(jié)合的最好，通過Ligplot1.4.5軟件進行相互作用分析，結(jié)果以氫鍵、疏水作用輸出，篩選關(guān)鍵的氨基酸位點。結(jié)果由圖1顯示，Diosmetin與HIV-1蛋白酶相互作用形成四個氫鍵(Gly27、Gly48、Gly49、Arg8)，Harmonyl與HIV-1蛋白酶相互作用形成兩個氫鍵(Arg8、Asp30)；結(jié)果由圖2顯示，2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate和Supraene與組織蛋白酶L相互作用有很大的相似性，與Asp72、Met71、Leu70等氨基酸殘基類型及相對位置相同。

圖1 Diosmetin (A)和Harmonyl(B)與HIV-1蛋白酶相互作用的關(guān)鍵氨基酸圖

圖2 2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate(A)和Supraene(B)與組織蛋白酶 L相互作用的關(guān)鍵氨基酸圖

3.4 復(fù)方一枝黃花噴霧劑關(guān)鍵活性成分理化性質(zhì)分析 通過分子對接分子發(fā)現(xiàn)復(fù)方一枝黃花噴霧劑16個化學(xué)成分與HIV-1和Cathepsin L分子對接得分均大于5，雖然尚未超過陽性藥，但是可能與HIV-1和Cathepsin L具有潛在的結(jié)合，因此對復(fù)方一枝黃花16個化學(xué)成分進行ADMET性質(zhì)分析，為體內(nèi)實驗做準(zhǔn)備。BBB<-0.3 的化合物被認為是非穿透性(BBB-)，從-0.3到0.3的中等穿透性(BBB±)，并且 >0.3表示強穿透力(BBB+)。Caco-2細胞模型作為一個標(biāo)準(zhǔn)的小腸滲透篩選模型已經(jīng)被越來越廣泛的接受。根據(jù)Lipinski規(guī)則，小分子應(yīng)該具備H-bond acceptors<5，H-bond donors<10，Rotatable bonds<10。如果過多參數(shù)不符合，會影響藥物的溶解性及腸吸收能力，16個化學(xué)成分，具有較好的口服吸收利用度，基本遵循Lipinski規(guī)則(表3)。

表3 復(fù)方一枝黃花噴霧劑關(guān)鍵活性成分

4 討論

人類的健康與生存受到病毒的嚴(yán)重威脅，其中病毒蛋白酶可將前體蛋白剪切修飾得到成熟蛋白[11]。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染可導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，導(dǎo)致全身免疫功能衰竭并產(chǎn)生并發(fā)癥[12]?？笻IV-1藥物目前有整合酶抑制劑(INIs)、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(RTIs)、蛋白酶抑制劑(PIs)等，抗HIV-1蛋白酶抑制劑已經(jīng)有10個[13]。組織蛋白酶L分布廣泛，如細胞質(zhì)、細胞核和細胞外基質(zhì)中，參與蛋白質(zhì)降解及維持細胞內(nèi)蛋白平衡，與多種病理生理過程相關(guān)。已經(jīng)有相關(guān)研究[14]表明抑制組織蛋白酶L過度激活已成為治療相關(guān)炎癥性疾病的重要靶標(biāo)。目前，已經(jīng)篩選出多種類型的抗 HIV-1天然化合物，但是作用于HIV-1整合酶和蛋白酶的比較少。進一步研究開發(fā)新的組織蛋白酶L和HIV-1抑制劑藥物，具有廣闊發(fā)展前景。 復(fù)方一枝黃花噴霧劑由一枝黃花、貫眾、山銀花、連翹、荊芥、艾納香、薄荷制成的噴霧劑。收集復(fù)方一枝黃花噴霧劑化學(xué)成分，有望從中篩選出抗HIV-1蛋白酶和Cathepsin L的抑制劑，通過分子對接發(fā)現(xiàn)復(fù)方一枝黃花噴霧劑有潛在的抗HIV-1和Cathepsin L的化學(xué)成分，在今后的研究中，我們將選擇篩選出的有效的抗HIV-1和Cathepsin L化學(xué)成分進行體內(nèi)研究，進一步驗證其篩選結(jié)果。