邱豐艷，韓飛，沈潔，戴盡波，洪燕萍

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364012； 2.汕頭職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)系，廣東汕頭 515041；3.梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣東梅州 514015)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們消費(fèi)水平的提高，化妝品逐漸成為不可或缺的生活必需品[1-3]，消費(fèi)群體涵蓋從嬰幼兒到老人各個(gè)年齡段。兒童皮膚嬌嫩、抵抗力弱，易受傷害，隨著育兒觀念的轉(zhuǎn)變，越來越多家長選擇嬰幼兒專屬化妝品。化妝品由多種成分調(diào)配而成，各種化學(xué)成分的添加可能引入各類殘留污染[4-6]。國家食品藥品監(jiān)督管理總局2015 年發(fā)布的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中明確規(guī)定了1 388 種化妝品禁用組分[7-8]。由于化妝品原材料多樣，產(chǎn)品成分各異，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定禁用物質(zhì)中仍然有一部分缺少相關(guān)檢測(cè)方法，是化妝品中不可忽視的質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)源[9-10]。

含酮基或芳香基團(tuán)的化合物因具有特殊香氣而常用作化妝品的香料成分或增香劑，但同時(shí)也是常見的過敏原[11-13]。除了歐盟化妝品法規(guī)(EC1223-2009-EU)中規(guī)定超過特定使用量必須在化妝品標(biāo)簽中標(biāo)注的檸檬醛和香豆素等26 種致敏原外，化妝品原料中仍存在許多易致消費(fèi)者過敏的香料成分，比如1-(4-甲氧苯基)-1-戊烯-3-酮、5-甲基-2，3-己二酮、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、2-羥基苯并咪唑和反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮[14-17]。由于這類化合物對(duì)消費(fèi)者具有較明顯的毒性和危害，在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中明確標(biāo)注為禁用成分，但缺乏相關(guān)檢測(cè)方法，有必要開展檢測(cè)方法研究。

由于化妝品形態(tài)多樣，包括固體、液體、乳狀、膏狀等，各類樣品基體不同，成分復(fù)雜，且基質(zhì)干擾多，若采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)，可根據(jù)待測(cè)物分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)式等信息獲得其精確相對(duì)分子質(zhì)量，在高達(dá)上萬的質(zhì)譜分辨能力(FWHM)下，可利用精確相對(duì)分子質(zhì)量作為待測(cè)物的確證信息而完成定性[18-21]。筆者采用LC-MS/MS法，圍繞嬰幼兒洗發(fā)液、沐浴液、爽身粉、潤膚乳、牙膏等化妝品中5 種禁用酮類組分，建立該類組分的定性確證和定量測(cè)定方法，該法可有效去除基質(zhì)干擾，適用于嬰幼兒化妝品中酮類香料的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：TRIPLE QUAD 3500型，美國AB SCIEX 公司。

分析天平：CPA324S 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯集團(tuán)。

超純水系統(tǒng)：Milli-Q 型，美國密理博公司。

氮吹儀：BYDCY-12Y 型，上海秉越電子儀器有限公司。

1-(4- 甲 氧 苯 基)-1- 戊 烯-3- 酮(CAS：104-27-8，縮 寫MPO)、5- 甲 基-2，3- 己 二 酮(CAS：13706-86-0，縮 寫ALO)、1- 乙 烯 基-2- 吡 咯 烷 酮(CAS：88-12-0，縮寫VPO)、2-羥基苯并咪唑(CAS：615-16-7，縮寫B(tài)DO)和反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮(CAS：122-57-6，縮寫PBO)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))均不小于99%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

氬氣、氮?dú)猓杭兌染笥?9.999%。

乙腈、乙醇、元乙酸乙酯：均為色譜純，美國默克公司。

1.2 溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取5 種禁用酮類香料標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg(精確至0.1 mg)，用5%甲醇溶液溶解并定容至100 mL，分別制備成質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL 的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃避光保存。不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由單標(biāo)儲(chǔ)備溶液混合，以5%甲醇溶液稀釋制得。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜

色 譜 柱：SHIMADZU GIST-HP C18柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相流量：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：A 為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的甲酸水溶液，B 為甲醇，梯度洗脫，0～4.0 min 為5% B，4.0～4.5 min 為5%～95%B，4.5～5.5 min 為95%～98% B，5.5～8.0 min 為98%～100% B，8.0～12.0 min 為100%～5 % B。

1.3.2 質(zhì)譜

電噴霧離子化正離子模式(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描模式；離子源配噴霧電壓：5 000 V；離子化溫度：500 ℃；射入電壓：10 V；碰撞室射出電壓：9 V；碰撞氣：氬氣，壓力為55 kPa；氣簾氣、霧化氣、加熱輔助氣：均為氮?dú)?，壓力分別為138、138、138 kPa；其它相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 5 種禁用酮類香料的MRM 離子對(duì)和保留時(shí)間

1.4 樣品處理

稱取1 g 均勻嬰幼兒化妝品，加入10 mL 乙腈和5 g NaCl 后渦旋混勻，然后超聲提取10 min(功率為600 W)，以8 000 r/min 離心5 min，取上清液于10 mL 試管中，于35 ℃下以氮?dú)獯抵两?，?.0 mL 體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇溶液溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾，供LC-MS/MS 分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

分別取空白溶液、5 種禁用酮類香料系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，按照1.3 儀器工作條件，分別導(dǎo)入LC-MS/MS 儀進(jìn)行測(cè)定。利用色譜工作站軟件MultiQuant ?分析、處理數(shù)據(jù)，以禁用酮類化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、特征離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品溶液中各個(gè)禁用酮類香料的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取各組分質(zhì)量濃度均為0.1 μg/mL 的5 種酮類香料的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)蠕動(dòng)泵以10 μL/min 流量注入ESI 源進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過Q1 全掃模式獲得分子離子峰，用子離子模式對(duì)分子離子峰進(jìn)行分析，從打碎的離子中選取兩個(gè)特征離子作為定性和定量離子。用MRM 掃描模式優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量、入口電壓和碰撞室出口電壓，使得定量與定性離子強(qiáng)度響應(yīng)最大，優(yōu)化后的5 種禁用酮類質(zhì)譜參數(shù)見表1，總離子流色譜圖及MRM 色譜圖見圖1～圖6。

圖1 5 種禁用酮類香料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖

圖2 1-乙烯基-2-吡咯烷酮MRM 色譜圖

圖3 5-甲基-2，3-己二酮MRM 色譜圖

圖4 2-羥基苯并咪唑MRM 色譜圖

圖5 反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮MRM 色譜圖

圖6 1-(4-甲氧苯基)-1-戊烯-3-酮MRM 色譜圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

比較了不同類型色譜柱(BEH-amide 色譜柱、C8色譜柱、F5色譜柱、HP-C18、T3 色譜柱)和流動(dòng)相(乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.01%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol 乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和0.2%氨水溶液)對(duì)5 種禁用酮類香料的色譜分離效果。試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)使用HP-C18色譜柱作為分析柱時(shí)，以甲醇-0.01%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，5 種禁用酮類香料獲得了良好的分離效果，峰形尖銳且對(duì)稱，保留時(shí)間適中；在其它色譜柱或流動(dòng)相中，部分目標(biāo)化合物出現(xiàn)分離效果較差，響應(yīng)值低，色譜峰拖尾或出現(xiàn)分叉峰；甲酸的加入可有效調(diào)節(jié)酮類化合物解離，改善峰形，增強(qiáng)正離子模式電離效率，因此實(shí)驗(yàn)選擇以HP-C18色譜柱作為分析柱，甲醇-0.01%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.3 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化

化妝品的基質(zhì)較為復(fù)雜，因此需要選擇合適的提取溶劑。選取3 種不同的提取溶劑(甲醇、乙腈、乙酸乙酯)和不同的超聲時(shí)間(5、10、15、20、25 min)考察對(duì)應(yīng)的5 種禁用酮類香料的提取率，結(jié)果見圖7。

圖7 不同溶劑對(duì)應(yīng)的5 種禁用酮類的提取率

試驗(yàn)結(jié)果表明：在相同的超聲時(shí)間下，以甲醇為提取溶劑時(shí)，甲醇和水相無法分層，溶液較為渾濁，后續(xù)過濾分離較為困難；以乙腈和乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)，在加入氯化鈉的情況下，乙腈和乙酸乙酯均能與水相分層，5 種禁用酮類化合物的提取率為81.3%～98.4%；由于乙酸乙酯和正己烷互溶，因此無法通過加入正己烷以進(jìn)一步除去雜質(zhì)，而在乙腈中加入正己烷后，對(duì)5 種禁用酮類化合物的提取率無顯著影響。因此選取乙腈為提取溶劑，在該條件下，考察了超聲時(shí)間對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間的增加，提取率增大，當(dāng)超過10 min 后，提取率增大不明顯，因此選擇超聲時(shí)間為10 min。

2.4 基質(zhì)干擾的影響

為避免不同嬰幼兒化妝品基質(zhì)對(duì)5 種禁用酮類香料檢測(cè)的干擾，在純乙腈和空白嬰幼兒化妝品中采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，按照式(1)計(jì)算并評(píng)價(jià)嬰幼兒化妝品中5 種禁用酮類香料的基質(zhì)效應(yīng)Me：

式中：A——純乙腈中目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度；

B——空白嬰幼兒化妝品中目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度。

當(dāng)B＜A時(shí)，為基質(zhì)減弱效應(yīng)；當(dāng)Me＜10%時(shí)，表明為不存在基質(zhì)干擾現(xiàn)象；當(dāng)20%＞Me ＞10%時(shí)，表明為低程度基質(zhì)干擾現(xiàn)象；當(dāng)50%＞Me ＞20%時(shí)，表明為中程度基質(zhì)干擾；當(dāng)Me ＞50%時(shí)，表明為高程度基質(zhì)干擾。

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法在純乙腈和空白嬰幼兒化妝品兩種不同基質(zhì)中分別加入0.1、0.5、1.0 μg/kg三種濃度的5 種禁用酮類香料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用所建LC-MS/MS 法測(cè)定5 種禁用酮類香料的基質(zhì)效應(yīng)Me 值，結(jié)果見表2。由表2 可知，基質(zhì)效應(yīng)Me 為3.1%～7.2%，說明不存在基質(zhì)干擾現(xiàn)象。

表2 5 種禁用酮類香料的基質(zhì)效應(yīng)Me 測(cè)定值

2.5 線性方程、線性范圍和方法檢出限

配制各組分質(zhì)量濃度均分別為0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3 儀器工作條件分析，以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、特征離子的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行線性相關(guān)分析。

按照國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)的規(guī)定，對(duì)空白溶液連續(xù)測(cè)定20 次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別以3 倍和10 倍的標(biāo)準(zhǔn)差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算檢出限和定量限。

5 種禁用酮類化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限列于表3。由表3 可知，5 種禁用酮類化合物質(zhì)量濃度在0.5～50.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.998；檢 出 限 為0.03～0.15 μg/kg，定 量 限 為0.1～0.5 μg/kg，可用于嬰幼兒護(hù)膚品中5 種禁用酮類香料的痕量檢測(cè)。

表3 5 種禁用酮類化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在嬰幼兒化妝品樣品(洗發(fā)水、沐浴液、潤膚乳)中依次添加5 種禁用酮類香料化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其最終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0 μg/mL，在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，結(jié)果見表4，加標(biāo)嬰幼兒潤膚乳樣品總離子流色譜圖見圖8。

圖8 加標(biāo)嬰幼兒潤膚乳樣品總離子流色譜圖

表4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表4 可知，5 種禁用酮類香料化合物的加標(biāo)回收率為84.3%～100.6%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～3.8%(n=6)，表明該方法精密度和準(zhǔn)確度均較高。

3 結(jié)語

以5 種禁用酮類香料化合物為研究對(duì)象，采用乙腈萃取嬰幼兒化妝品，經(jīng)超聲萃取，氮吹濃縮，建立了嬰幼兒化妝品中5 種禁用酮類香料的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速篩查方法。該法具有回收率高、檢出限低、精密度好等優(yōu)點(diǎn)，可為進(jìn)一步補(bǔ)充和完善嬰幼兒化妝品中禁用酮類物質(zhì)的衛(wèi)生規(guī)范和質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支持。