邱豐艷,韓飛,沈潔,戴盡波,洪燕萍
(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建龍巖 364012; 2.汕頭職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)系,廣東汕頭 515041;3.梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所,廣東梅州 514015)
隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們消費(fèi)水平的提高,化妝品逐漸成為不可或缺的生活必需品[1-3],消費(fèi)群體涵蓋從嬰幼兒到老人各個(gè)年齡段。兒童皮膚嬌嫩、抵抗力弱,易受傷害,隨著育兒觀念的轉(zhuǎn)變,越來越多家長選擇嬰幼兒專屬化妝品。化妝品由多種成分調(diào)配而成,各種化學(xué)成分的添加可能引入各類殘留污染[4-6]。國家食品藥品監(jiān)督管理總局2015 年發(fā)布的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中明確規(guī)定了1 388 種化妝品禁用組分[7-8]。由于化妝品原材料多樣,產(chǎn)品成分各異,《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定禁用物質(zhì)中仍然有一部分缺少相關(guān)檢測(cè)方法,是化妝品中不可忽視的質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)源[9-10]。
含酮基或芳香基團(tuán)的化合物因具有特殊香氣而常用作化妝品的香料成分或增香劑,但同時(shí)也是常見的過敏原[11-13]。除了歐盟化妝品法規(guī)(EC1223-2009-EU)中規(guī)定超過特定使用量必須在化妝品標(biāo)簽中標(biāo)注的檸檬醛和香豆素等26 種致敏原外,化妝品原料中仍存在許多易致消費(fèi)者過敏的香料成分,比如1-(4-甲氧苯基)-1-戊烯-3-酮、5-甲基-2,3-己二酮、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、2-羥基苯并咪唑和反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮[14-17]。由于這類化合物對(duì)消費(fèi)者具有較明顯的毒性和危害,在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中明確標(biāo)注為禁用成分,但缺乏相關(guān)檢測(cè)方法,有必要開展檢測(cè)方法研究。
由于化妝品形態(tài)多樣,包括固體、液體、乳狀、膏狀等,各類樣品基體不同,成分復(fù)雜,且基質(zhì)干擾多,若采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS),可根據(jù)待測(cè)物分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)式等信息獲得其精確相對(duì)分子質(zhì)量,在高達(dá)上萬的質(zhì)譜分辨能力(FWHM)下,可利用精確相對(duì)分子質(zhì)量作為待測(cè)物的確證信息而完成定性[18-21]。筆者采用LC-MS/MS法,圍繞嬰幼兒洗發(fā)液、沐浴液、爽身粉、潤膚乳、牙膏等化妝品中5 種禁用酮類組分,建立該類組分的定性確證和定量測(cè)定方法,該法可有效去除基質(zhì)干擾,適用于嬰幼兒化妝品中酮類香料的分析。
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:TRIPLE QUAD 3500型,美國AB SCIEX 公司。
分析天平:CPA324S 型,感量為0.1 mg,德國賽多利斯集團(tuán)。
超純水系統(tǒng):Milli-Q 型,美國密理博公司。
氮吹儀:BYDCY-12Y 型,上海秉越電子儀器有限公司。
1-(4- 甲 氧 苯 基)-1- 戊 烯-3- 酮(CAS:104-27-8,縮 寫MPO)、5- 甲 基-2,3- 己 二 酮(CAS:13706-86-0,縮 寫ALO)、1- 乙 烯 基-2- 吡 咯 烷 酮(CAS:88-12-0,縮寫VPO)、2-羥基苯并咪唑(CAS:615-16-7,縮寫B(tài)DO)和反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮(CAS:122-57-6,縮寫PBO)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))均不小于99%,德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。
氬氣、氮?dú)猓杭兌染笥?9.999%。
乙腈、乙醇、元乙酸乙酯:均為色譜純,美國默克公司。
分別準(zhǔn)確稱取5 種禁用酮類香料標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg(精確至0.1 mg),用5%甲醇溶液溶解并定容至100 mL,分別制備成質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL 的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液,于4 ℃避光保存。不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由單標(biāo)儲(chǔ)備溶液混合,以5%甲醇溶液稀釋制得。
1.3.1 色譜
色 譜 柱:SHIMADZU GIST-HP C18柱(100 mm×2.1 mm,3 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相流量:0.4 mL/min;進(jìn)樣體積:5 μL;流動(dòng)相:A 為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)的甲酸水溶液,B 為甲醇,梯度洗脫,0~4.0 min 為5% B,4.0~4.5 min 為5%~95%B,4.5~5.5 min 為95%~98% B,5.5~8.0 min 為98%~100% B,8.0~12.0 min 為100%~5 % B。
1.3.2 質(zhì)譜
電噴霧離子化正離子模式(ESI+);多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描模式;離子源配噴霧電壓:5 000 V;離子化溫度:500 ℃;射入電壓:10 V;碰撞室射出電壓:9 V;碰撞氣:氬氣,壓力為55 kPa;氣簾氣、霧化氣、加熱輔助氣:均為氮?dú)?,壓力分別為138、138、138 kPa;其它相關(guān)參數(shù)見表1。
表1 5 種禁用酮類香料的MRM 離子對(duì)和保留時(shí)間
稱取1 g 均勻嬰幼兒化妝品,加入10 mL 乙腈和5 g NaCl 后渦旋混勻,然后超聲提取10 min(功率為600 W),以8 000 r/min 離心5 min,取上清液于10 mL 試管中,于35 ℃下以氮?dú)獯抵两?,?.0 mL 體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇溶液溶解殘?jiān)?,?jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾,供LC-MS/MS 分析。
分別取空白溶液、5 種禁用酮類香料系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液,按照1.3 儀器工作條件,分別導(dǎo)入LC-MS/MS 儀進(jìn)行測(cè)定。利用色譜工作站軟件MultiQuant ?分析、處理數(shù)據(jù),以禁用酮類化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、特征離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品溶液中各個(gè)禁用酮類香料的含量。
取各組分質(zhì)量濃度均為0.1 μg/mL 的5 種酮類香料的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)蠕動(dòng)泵以10 μL/min 流量注入ESI 源進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過Q1 全掃模式獲得分子離子峰,用子離子模式對(duì)分子離子峰進(jìn)行分析,從打碎的離子中選取兩個(gè)特征離子作為定性和定量離子。用MRM 掃描模式優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量、入口電壓和碰撞室出口電壓,使得定量與定性離子強(qiáng)度響應(yīng)最大,優(yōu)化后的5 種禁用酮類質(zhì)譜參數(shù)見表1,總離子流色譜圖及MRM 色譜圖見圖1~圖6。
圖1 5 種禁用酮類香料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖
圖2 1-乙烯基-2-吡咯烷酮MRM 色譜圖
圖3 5-甲基-2,3-己二酮MRM 色譜圖
圖4 2-羥基苯并咪唑MRM 色譜圖
圖5 反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮MRM 色譜圖
圖6 1-(4-甲氧苯基)-1-戊烯-3-酮MRM 色譜圖
比較了不同類型色譜柱(BEH-amide 色譜柱、C8色譜柱、F5色譜柱、HP-C18、T3 色譜柱)和流動(dòng)相(乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.01%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol 乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和0.2%氨水溶液)對(duì)5 種禁用酮類香料的色譜分離效果。試驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)使用HP-C18色譜柱作為分析柱時(shí),以甲醇-0.01%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí),5 種禁用酮類香料獲得了良好的分離效果,峰形尖銳且對(duì)稱,保留時(shí)間適中;在其它色譜柱或流動(dòng)相中,部分目標(biāo)化合物出現(xiàn)分離效果較差,響應(yīng)值低,色譜峰拖尾或出現(xiàn)分叉峰;甲酸的加入可有效調(diào)節(jié)酮類化合物解離,改善峰形,增強(qiáng)正離子模式電離效率,因此實(shí)驗(yàn)選擇以HP-C18色譜柱作為分析柱,甲醇-0.01%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。
化妝品的基質(zhì)較為復(fù)雜,因此需要選擇合適的提取溶劑。選取3 種不同的提取溶劑(甲醇、乙腈、乙酸乙酯)和不同的超聲時(shí)間(5、10、15、20、25 min)考察對(duì)應(yīng)的5 種禁用酮類香料的提取率,結(jié)果見圖7。
圖7 不同溶劑對(duì)應(yīng)的5 種禁用酮類的提取率
試驗(yàn)結(jié)果表明:在相同的超聲時(shí)間下,以甲醇為提取溶劑時(shí),甲醇和水相無法分層,溶液較為渾濁,后續(xù)過濾分離較為困難;以乙腈和乙酸乙酯為提取溶劑時(shí),在加入氯化鈉的情況下,乙腈和乙酸乙酯均能與水相分層,5 種禁用酮類化合物的提取率為81.3%~98.4%;由于乙酸乙酯和正己烷互溶,因此無法通過加入正己烷以進(jìn)一步除去雜質(zhì),而在乙腈中加入正己烷后,對(duì)5 種禁用酮類化合物的提取率無顯著影響。因此選取乙腈為提取溶劑,在該條件下,考察了超聲時(shí)間對(duì)回收率的影響,發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間的增加,提取率增大,當(dāng)超過10 min 后,提取率增大不明顯,因此選擇超聲時(shí)間為10 min。
為避免不同嬰幼兒化妝品基質(zhì)對(duì)5 種禁用酮類香料檢測(cè)的干擾,在純乙腈和空白嬰幼兒化妝品中采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,按照式(1)計(jì)算并評(píng)價(jià)嬰幼兒化妝品中5 種禁用酮類香料的基質(zhì)效應(yīng)Me:
式中:A——純乙腈中目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度;
B——空白嬰幼兒化妝品中目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度。
當(dāng)B<A時(shí),為基質(zhì)減弱效應(yīng);當(dāng)Me<10%時(shí),表明為不存在基質(zhì)干擾現(xiàn)象;當(dāng)20%>Me >10%時(shí),表明為低程度基質(zhì)干擾現(xiàn)象;當(dāng)50%>Me >20%時(shí),表明為中程度基質(zhì)干擾;當(dāng)Me >50%時(shí),表明為高程度基質(zhì)干擾。
采用標(biāo)準(zhǔn)加入法在純乙腈和空白嬰幼兒化妝品兩種不同基質(zhì)中分別加入0.1、0.5、1.0 μg/kg三種濃度的5 種禁用酮類香料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用所建LC-MS/MS 法測(cè)定5 種禁用酮類香料的基質(zhì)效應(yīng)Me 值,結(jié)果見表2。由表2 可知,基質(zhì)效應(yīng)Me 為3.1%~7.2%,說明不存在基質(zhì)干擾現(xiàn)象。
表2 5 種禁用酮類香料的基質(zhì)效應(yīng)Me 測(cè)定值
配制各組分質(zhì)量濃度均分別為0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3 儀器工作條件分析,以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、特征離子的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行線性相關(guān)分析。
按照國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)的規(guī)定,對(duì)空白溶液連續(xù)測(cè)定20 次,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差,分別以3 倍和10 倍的標(biāo)準(zhǔn)差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算檢出限和定量限。
5 種禁用酮類化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限列于表3。由表3 可知,5 種禁用酮類化合物質(zhì)量濃度在0.5~50.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r≥0.998;檢 出 限 為0.03~0.15 μg/kg,定 量 限 為0.1~0.5 μg/kg,可用于嬰幼兒護(hù)膚品中5 種禁用酮類香料的痕量檢測(cè)。
表3 5 種禁用酮類化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
在嬰幼兒化妝品樣品(洗發(fā)水、沐浴液、潤膚乳)中依次添加5 種禁用酮類香料化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其最終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0 μg/mL,在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次,結(jié)果見表4,加標(biāo)嬰幼兒潤膚乳樣品總離子流色譜圖見圖8。
圖8 加標(biāo)嬰幼兒潤膚乳樣品總離子流色譜圖
表4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
由表4 可知,5 種禁用酮類香料化合物的加標(biāo)回收率為84.3%~100.6%,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%~3.8%(n=6),表明該方法精密度和準(zhǔn)確度均較高。
以5 種禁用酮類香料化合物為研究對(duì)象,采用乙腈萃取嬰幼兒化妝品,經(jīng)超聲萃取,氮吹濃縮,建立了嬰幼兒化妝品中5 種禁用酮類香料的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速篩查方法。該法具有回收率高、檢出限低、精密度好等優(yōu)點(diǎn),可為進(jìn)一步補(bǔ)充和完善嬰幼兒化妝品中禁用酮類物質(zhì)的衛(wèi)生規(guī)范和質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支持。