白國(guó)棟，顏 譚，王凱斌，付澤華，劉娟妮，廖和和

(陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院腫瘤外科，陜西 咸陽(yáng) 712000)

全球每年新增乳腺癌患者約200萬(wàn)例，占所有新增腫瘤患者的11.6%，排名第一；每年死于乳腺癌的患者約60萬(wàn)例，占所有腫瘤死亡患者的18.4%，排名第四[1]。免疫抑制在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用，Th1型免疫細(xì)胞可促進(jìn)干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)表達(dá)，以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[2]。自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞可以靶向識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，活化的NK細(xì)胞可分泌大量IFN-γ和肺癌壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α),從而抑制乳腺癌進(jìn)展[3]。

腫瘤細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類鏈相關(guān)分子A(major histocompatibility complexclass I-chain related A，MICA)蛋白具有免疫調(diào)節(jié)的作用，MICA蛋白表達(dá)降低與乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為有關(guān)，而MICA蛋白表達(dá)升高可激活NK細(xì)胞和Th1細(xì)胞，清除腫瘤細(xì)胞[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)不具備編碼能力，但可以與信使RNA(message RNA，mRNA)靶向結(jié)合，并使其降解[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),其可以增加乳腺癌的惡性程度及骨轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[6]。此外，miR-20a也可以調(diào)控機(jī)體對(duì)乳腺癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，但其相關(guān)機(jī)制仍不清楚。因此，本研究旨在分析miR-20a靶向調(diào)控MICA對(duì)乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及IFN-γ和TNF-α的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7(批號(hào)：AC-2338H)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：11965092)、胎牛血清(批號(hào)：10100147)和LipofectamineTM2000(批號(hào)：12566014)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，miR-20a mimics(批號(hào)：C09001-20a)、miR-20a inhibitor(批號(hào)：C09004-20a)和陰性對(duì)照(批號(hào)：C06027)購(gòu)自上海吉瑪公司，miRNeasy Mini試劑盒(批號(hào)：217004)購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司，TaqMan miRNA試劑盒(批號(hào)：4427014)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，MICA(批號(hào)：ab62540-MICA)和β-actin(批號(hào)：ab179467)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，基質(zhì)膠(批號(hào)：356234)和Transwell小室(批號(hào)：338123)購(gòu)自美國(guó)Corning公司，快速定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?批號(hào)：D0208S)、Renilla熒光素酶質(zhì)粒(批號(hào)：RG062S)購(gòu)自上海碧云天公司，熒光素酶報(bào)告試劑盒(批號(hào)：E1500)和1000 System檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：E606336)購(gòu)自上海生工公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司，顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，Odyssey曝光儀購(gòu)自美國(guó)奧德賽公司。TNF-α(批號(hào)：EK-H12145)、IFN-γ(批號(hào)：EK-H12415)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將MCF-7細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-20a mimics組、miR-20a inhibitor組。根據(jù)組別，采用LipofectamineTM2000將miR-20a mimics、miR-20a inhibitor和陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞，具體方法如下：將MCF-7細(xì)胞種植于6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)，將LipofectamineTM2000和目的質(zhì)粒加入培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染16 h后，撤去含有質(zhì)粒的培養(yǎng)基，并采用PBS清洗，然后收集目的細(xì)胞。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 RT-qPCR檢測(cè)miR-20a表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)miRNeasy Mini試劑盒操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。采用TaqMan miRNA試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-20a相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染細(xì)胞達(dá)到80%融合后，取各組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板中(細(xì)胞濃度為2×103個(gè)/孔)，隨后將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞融合為60%左右后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，之后分別在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h、48 h。隨后用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞 450 nm波長(zhǎng)處光密度(optical density，OD)值。

1.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓處理，隨后向預(yù)先鋪好基質(zhì)膠(1∶8稀釋)的Transwell上室中加入100 μL密度為5×105/mL的細(xì)胞溶液，24孔板Transwell小室下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。24 h后，細(xì)胞用95%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。隨后在顯微鏡下(×400倍)隨機(jī)選取5個(gè)視野并計(jì)數(shù)。

1.3.4 ELISA檢測(cè)IFN-γ和TNF-α水平 棄細(xì)胞培養(yǎng)基，使用蛋白裂解液吹打處理后的細(xì)胞，收集至1.5 mL無(wú)酶EP管，12 000 r/min離心20 min，收集細(xì)胞上清，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，隨后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)基中IFN-γ和TNF-α的濃度。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)miR-20a和MICA的靶向結(jié)合 在Starbase網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)獲取MICA和miR-20a的堿基結(jié)合位點(diǎn)。野生型MICA(Wt-MICA)序列擴(kuò)增到pGL4熒光素酶載體后，通過(guò)快速定點(diǎn)誘變?cè)噭┖猩赏蛔冃蚆ICA(Mut-MICA)。24孔板中每孔接種3×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。將1 μg Wt-MICA/Mut-MICA熒光素酶質(zhì)粒通過(guò)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，分別轉(zhuǎn)染miR-20a mimics或陰性質(zhì)粒。37 ℃孵育36 h，然后通過(guò)熒光素酶報(bào)告試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，即相對(duì)光單位(relative light unit，RLU)，將Renilla熒光素酶活性作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 收集1×106個(gè)細(xì)胞并用100 μL PBS重懸，根據(jù)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)雙染色15 min。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡水平。

1.3.7 Western blot檢測(cè)MICA蛋白表達(dá) 收集5×106個(gè)乳腺癌細(xì)胞，經(jīng)裂解后提取總蛋白并檢測(cè)濃度。加入SDS蛋白上樣緩沖液，煮沸變性后，取20 μg蛋白樣品加入12%預(yù)制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后加入一抗MICA抗體(1∶500)或β-actin抗體(1∶2 000)，4 ℃過(guò)夜。TBST洗滌3次，加入免疫熒光二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌后用Odyssey曝光儀檢測(cè)，以β-actin做標(biāo)準(zhǔn)化處理，用Image J分析灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MiR-20a的相對(duì)表達(dá)水平

MiR-20a mimics組的miR-20a相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，miR-20a inhibitor組的miR-20a相對(duì)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功，見(jiàn)圖1。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.2 MiR-20a對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

轉(zhuǎn)染miR-20a mimics 24 h和48 h時(shí)MCF-7細(xì)胞的OD值均高于對(duì)照組(P<0.05)，表明細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；而轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor 24 h和48 h時(shí)其OD值則均低于對(duì)照組(P<0.05)，表明細(xì)胞增殖能力減弱，見(jiàn)圖2。此外，與對(duì)照組比較，miR-20a mimics組細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P<0.05)，而miR-20a inhibitor組細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.3 MiR-20a對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

與對(duì)照組比較，miR-20a mimics組侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著增加，miR-20a inhibitor組的侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.4 MiR-20a對(duì)乳腺癌細(xì)胞IFN-γ和TNF-α表達(dá)水平的影響

MiR-20a mimics組的IFN-γ和TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，miR-20a inhibitor組的IFN-γ和TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.5 MiR-20a對(duì)乳腺癌細(xì)胞MICA蛋白表達(dá)水平的影響

MiR-20a mimics組的MICA蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，miR-20a inhibitor組的MICA蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.6 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證miR-20a與MICA的靶向關(guān)系

MiR-20a與MICA的靶向結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖7。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，Wt-MICA和miR-20a mimics共同轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖8。提示miR-20a與MICA靶向結(jié)合。

圖7 MiR-20a與MICA基因的結(jié)合位點(diǎn)

*：與Mut-MICA比較，P<0.05；#：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.7 MiR-20a對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，miR-20a mimics組細(xì)胞凋亡率明顯較低，miR-20a inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖9。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05

3 討論

乳腺癌是引起全球女性癌癥死亡的首要原因之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，死于惡性腫瘤的女性中約有15%的病例死于乳腺癌[7]?；瘜W(xué)療法作為現(xiàn)階段治療晚期乳腺癌的主要方法之一，應(yīng)用最為廣泛，但是仍有部分患者對(duì)化學(xué)療法不敏感。更重要的是，盡管化學(xué)療法和激素療法可取得令人滿意的短期效果，但仍有20%的患者會(huì)在治療后10年內(nèi)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[8]。因此，探究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制對(duì)其治療具有重要意義。

MiRNA可通過(guò)堿基配對(duì)識(shí)別并結(jié)合mRNA，進(jìn)而誘導(dǎo)mRNA降解，或抑制mRNA翻譯[9]。研究顯示，miR-20a作為新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)miRNA，其在膀胱癌[10]、前列腺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]等中均發(fā)揮著促癌作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[13]。此外，miR-20a還具有促進(jìn)免疫抑制的作用，其通過(guò)下調(diào)RUNX1蛋白的表達(dá)抑制NK細(xì)胞對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用，并抑制TNF-α和IFN-γ的表達(dá)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-20a可顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲并抑制TNF-α和IFN-γ的分泌，而抑制miR-20a則會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲，并促進(jìn)TNF-α和IFN-γ的分泌，提示miR-20a參與乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為并調(diào)控TNF-α和IFN-γ的分泌。

本研究還檢測(cè)了MICA蛋白的表達(dá)水平，以探究miR-20a對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制。MICA主要表達(dá)于胃上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的表面以及單核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[15]。MICA可作為NK細(xì)胞活化性受體NKG2D的配體，能通過(guò)NKG2D途徑調(diào)控免疫細(xì)胞的殺傷力，解除免疫抑制，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。研究顯示，提高M(jìn)ICA的表達(dá)能夠提高免疫細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷力[17]。IFN-γ和TNF-α均是抑癌細(xì)胞因子，其在正常細(xì)胞中低表達(dá)，而上調(diào)IFN-γ和TNF-α的表達(dá)則對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有抗增殖效應(yīng)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，miR-20a高表達(dá)不但會(huì)促進(jìn)乳腺癌的惡性生物學(xué)行為、誘導(dǎo)免疫抑制，還會(huì)顯著抑制MICA蛋白的表達(dá)。而研究也表明，MICA高表達(dá)會(huì)通過(guò)促進(jìn)IFN-γ和TNF-α的表達(dá)來(lái)解除免疫抑制，從而發(fā)揮抑癌作用[20-21]。本研究還通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告證實(shí)了miR-20a與MICA的靶向結(jié)合，這提示miR-20a可通過(guò)靶向抑制MICA蛋白的表達(dá)水平，從而促進(jìn)免疫抑制水平，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，miR-20a可能通過(guò)靶向MICA蛋白促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并抑制免疫促進(jìn)因子IFN-γ和TNF-α的表達(dá)，這提示miR-20a可能成為乳腺癌的治療靶點(diǎn)。然而，本研究也有一些不足之處，關(guān)于miR-20a靶向抑制MICA蛋白對(duì)乳腺癌的影響仍需要體內(nèi)研究證實(shí)，miR-20a和MICA在乳腺癌患者中的臨床意義也需要進(jìn)一步分析。