黃盼盼，顧 喬，曾小康

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310003)

膿毒癥的有效治療仍然是重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)的主要挑戰(zhàn)之一，其死亡率約為30%[1]。流行病學(xué)研究表明，近年來膿毒癥的發(fā)病率不斷上升，死亡率卻在下降。根據(jù)2016年歐洲危重病學(xué)會(huì)指定的19位國際專家合作修訂的膿毒癥的定義和診斷標(biāo)準(zhǔn)，即“膿毒癥-3”[2]標(biāo)準(zhǔn)定義，膿毒癥是由宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的威脅生命的器官功能紊亂。膿毒癥的發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括血流動(dòng)力學(xué)改變、腎血流量減少、微血栓形成、內(nèi)毒素和炎癥因子的影響及細(xì)胞凋亡等[3]。

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是與膿毒癥或膿毒癥休克相關(guān)的最常見的器官功能障礙之一，其死亡率高達(dá)60%[4-5]。AKI指的是腎臟功能突然下降(大部分是可逆的)，導(dǎo)致許多廢物的滯留和細(xì)胞外容量的失調(diào)。根據(jù)血清肌酐水平的升高水平和尿量的減少情況，改善全球腎臟病預(yù)后組織(Kidney Disease: Improving Global Outcomes，KDIGO)的分類標(biāo)準(zhǔn)被廣泛用于診斷AKI。然而，這些參數(shù)的變化并不能反映腎臟損傷的程度，因此需要更多敏感和特異的實(shí)驗(yàn)室生物標(biāo)志物來早期診斷和預(yù)測AKI。肌動(dòng)蛋白是一種球狀蛋白(Mr約為2 000)，以單體/球狀和聚合/絲狀的形式存在，可能是一種針對(duì)膿毒癥相關(guān)AKI(sepsis-associated acute kidney injury，saAKI)有潛力的生物標(biāo)志物[6]。在急性組織損傷中，釋放的細(xì)胞外肌動(dòng)蛋白被發(fā)現(xiàn)在血液循環(huán)中具有高毒性，因?yàn)樗哂凶园l(fā)的聚合傾向，對(duì)凝血系統(tǒng)產(chǎn)生不利的影響[7]。凝膠素和Gc-球蛋白是所謂的肌動(dòng)蛋白清道夫系統(tǒng)中最重要的蛋白，它們負(fù)責(zé)結(jié)合和解聚循環(huán)中的細(xì)胞外肌動(dòng)蛋白，使這些蛋白復(fù)合物在尿液中出現(xiàn)的可能性減小[8]。然而，有研究表明，在持續(xù)AKI的腎移植患者的尿液中可以檢測到肌動(dòng)蛋白[9]。本研究對(duì)saAKI患者尿液中的肌動(dòng)蛋白進(jìn)行定量檢測，以驗(yàn)證其作為saAKI中血清肌酐補(bǔ)充診斷生物標(biāo)志物的可行性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選取2020年1月至2021年12月在我院急性確診的膿毒癥患者或saAKI患者入組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷符合“膿毒癥-3”[2]以及KDIGO的AKI臨床指南標(biāo)準(zhǔn)[10]；②出現(xiàn)器官功能障礙跡象，表現(xiàn)為序貫性器官功能衰竭評(píng)分(Sequential Organ Failure Assessment，SOFA)增加(>2分)、血清降鈣素原(procalcitonin，PCT)水平升高(>2 μg/L)和微生物學(xué)感染；③血清肌酐水平升高(過去7 d從基線增加≥1.5倍或48 h內(nèi)增加≥26.5 μmol/L)或尿量減少[<0.5 mL/(kg·h)，持續(xù)6 h]的患者被認(rèn)定患有AKI。排除標(biāo)準(zhǔn)：①納入前3個(gè)月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素者，長期使用免疫抑制劑、免疫功能嚴(yán)重低下者；②既往有慢性腎病、腎移植史或終末期腎臟病患者；③合并間質(zhì)性腎炎、腎小球腎炎患者；④妊娠期、哺乳期及經(jīng)期患者；⑤合并血液系統(tǒng)傳染性疾病及惡性腫瘤患者。另選取同時(shí)期在我院門診中心體檢，并愿意加入實(shí)驗(yàn)的健康人群作為對(duì)照組，其排除標(biāo)準(zhǔn)為患有急性炎癥[超敏C-反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)>5 mg/L]、傳染病或腎臟疾病者。最終納入膿毒癥患者共65例，其中saAKI組45(男13，女32)例，非AKI膿毒癥組20(男8，女12)例。對(duì)照組25(男11，女14)例。三組對(duì)象的平均年齡、收縮壓、舒張壓、心率和BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。本研究經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)(ZJUL20190845LC)，所有患者或其家屬均簽署書面知情同意書。

表1 三組入組人群基本情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果

1.2 方法

1.2.1 采樣和樣本處理 本研究按前瞻性、開放、單中心臨床研究方法設(shè)計(jì)?；颊呷虢M后，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(T1，T2和T3)采集血液和尿液樣本。T1：入院后24 h內(nèi)；T2：入院后第2日上午；T3：入院后第3日上午。每位膿毒癥患者使用促凝管采集靜脈血5 mL，使用無菌離心管采集尿液6 mL；尿液和凝固的血液樣本經(jīng)1 500g離心10 min后，取上清液檢測。

1.2.2 檢測指標(biāo)和數(shù)據(jù)分析 血常規(guī)檢測包括血漿總蛋白、血漿白蛋白、肌酸激酶、血漿肌酐、血小板計(jì)數(shù)；炎癥指標(biāo)檢測包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、hs-CRP、PCT；尿常規(guī)檢測包括尿液總蛋白、尿液白蛋白、尿肌酐。以上檢測均在杭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。采用自動(dòng)化免疫比濁法(使用德國Roche診斷醫(yī)療生產(chǎn)的Cobas 8000/c502模塊進(jìn)行)測定尿液中指標(biāo)黏蛋白和胱抑素C。尿液肌動(dòng)蛋白則采用ELISA進(jìn)行測定，檢測試劑盒(ab240678)購自英國Abcam上海分公司。收集患者的臨床病理信息，與血清和尿液肌動(dòng)蛋白水平進(jìn)行比較，并通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)評(píng)估血清和尿液肌動(dòng)蛋白作為saAKI診斷指標(biāo)的有效性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。由于檢測數(shù)據(jù)未能通過正態(tài)分布檢驗(yàn)，計(jì)量資料均采用M(Q1，Q3)表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組入組人群基礎(chǔ)特征比較

對(duì)三組入組人群主要并發(fā)癥發(fā)生率進(jìn)行比較，結(jié)果表明，非AKI膿毒癥組和saAKI組患者并發(fā)心血管病、慢性腎病、肺部疾病和惡性腫瘤的比例顯著高于對(duì)照組患者(P<0.05)，非AKI膿毒癥組和saAKI組之間則無顯著差異(表2)。臨床血液和尿液指標(biāo)方面，非AKI膿毒癥組和saAKI組在血漿總蛋白、血漿白蛋白、血漿肌酐、血漿肌酸激酶、白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)、C-反應(yīng)蛋白、降鈣素原、尿液總蛋白、尿液白蛋白、尿液黏蛋白，尿液胱抑素、尿液肌動(dòng)蛋白和尿液肌動(dòng)蛋白/肌酐等指標(biāo)與對(duì)照組相比均存在顯著差異(P<0.05)。非AKI膿毒癥組和saAKI組組間則在血漿肌酐、白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)、尿液總蛋白、尿液白蛋白、尿液黏蛋白、尿液胱抑素、尿液肌動(dòng)蛋白、尿液肌動(dòng)蛋白/肌酐和尿液肌動(dòng)蛋白/總蛋白等指標(biāo)上差異顯著，saAKI組上述指標(biāo)數(shù)值均顯著較高(P<0.05，表3～4)。

表2 三組入組人群主要合并癥比較 [n(%)]

表3 三組入組人群臨床血液指標(biāo)比較 [M(Q1，Q3)]

表4 三組入組人群臨床尿液指標(biāo)比較 [M(Q1，Q3)]

2.2 非AKI膿毒癥組和saAKI組入院原因和臨床數(shù)據(jù)比較

非AKI膿毒癥組和saAKI組患者在內(nèi)科并發(fā)癥發(fā)生人數(shù)、手術(shù)干預(yù)人數(shù)、ICU住院時(shí)間、APACHE Ⅱ評(píng)分、SAPS Ⅱ評(píng)分和SOFA評(píng)分方面均存在顯著差異(P<0.05，表5)。saAKI組患者多器官功能障礙綜合征發(fā)病率較高，但兩組差異不顯著。臨床病原體分型方面，兩組也無顯著差異(表6)。

表5 入院原因和臨床診斷評(píng)分對(duì)比

表6 器官衰竭程度和病原體比較 [n(%)]

2.3 三組入組人群血清和尿液肌動(dòng)蛋白水平比較

在T1、T2和T3三個(gè)時(shí)間點(diǎn)所有膿毒癥患者中(n=65)的血清肌動(dòng)蛋白水平與對(duì)照組(n=25)比較未發(fā)現(xiàn)顯著差異，但是尿液肌動(dòng)蛋白水平在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均存在顯著差異(P<0.01，圖1A)；將非AKI膿毒癥組(n=20)和saAKI組(n=45)的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩組間血清肌動(dòng)蛋白水平無顯著差異，但是尿液肌動(dòng)蛋白水平在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均存在顯著差異(P<0.01，圖1B)；根據(jù)KDIGO指南分級(jí)說明對(duì)45例saAKI患者進(jìn)行了分級(jí)，分為AKI-1組(10例)，AKI-2組(15例)和AKI-3組(20例)，并對(duì)其肌動(dòng)蛋白檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，各組間尿液肌動(dòng)蛋白水平存在顯著差異(P<0.01，圖2A)；同時(shí)，各組間尿液肌動(dòng)蛋白/肌酐比值也存在顯著差異(P<0.01，圖2B)。

A：3個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組患者(n=25)和膿毒癥患者(n=65)尿液肌動(dòng)蛋白水平比較；B：非AKI膿毒癥組(n=20)和saAKI組(n=45)患者尿液肌動(dòng)蛋白水平比較。 bP<0.01。圖1 膿毒癥患者尿液肌動(dòng)蛋白水平

A：3個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同AKI分級(jí)患者的尿液肌動(dòng)蛋白水平比較；B：3個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同AKI分級(jí)患者的尿液肌動(dòng)蛋白/肌酐比值比較。AKI-1組n=10；AKI-2組n=15；AKI-3組n=20。 bP<0.01。圖2 不同AKI分級(jí)的saAKI患者的尿液肌動(dòng)蛋白水平比較

2.4 尿液肌動(dòng)蛋白水平對(duì)saAKI的診斷性能分析

通過使用ROC曲線分析評(píng)估了T1時(shí)間點(diǎn)各檢測指標(biāo)對(duì)saAKI的診斷性能(圖3)。對(duì)于區(qū)分saAKI和非AKI的膿毒癥患者，曲線下面積(area under the curve，AUC)值如下：尿液肌動(dòng)蛋白0.887(P<0.01)；血漿肌酐0.865(P<0.01)；檢驗(yàn)截止值如下，尿液肌動(dòng)蛋白2.67 μg/L(敏感度：85.0%，特異度：81.3%)；血漿肌酐121 μmol/L(敏感度：87.5%，特異度：75.2%)。

圖3 區(qū)分AKI的ROC曲線

3 討論

非AKI膿毒癥和saAKI的早期診斷和有效治療是保證患者成功康復(fù)的關(guān)鍵[11]。然而，目前使用的生物標(biāo)志物(膿毒癥相關(guān)：PCT、hs-CRP；AKI相關(guān)：肌酐、尿量)在膿毒癥和AKI的診斷和預(yù)后方面顯示出顯著局限性[12]。本研究檢驗(yàn)了患者血漿肌動(dòng)蛋白和尿液肌動(dòng)蛋白水平作為臨床生物標(biāo)志物的潛力。

越來越多的證據(jù)表明在各種臨床狀況下(如創(chuàng)傷、急性肝衰竭、心肌梗死、膿毒癥)，肌動(dòng)蛋白清除蛋白酶濃度下降以及血漿肌動(dòng)蛋白水平升高體現(xiàn)出的診斷價(jià)值[13]。由于尿液的采集是無創(chuàng)性的，利用尿液成分進(jìn)行疾病生物標(biāo)志物研究是目前的熱門。針對(duì)尿液肌動(dòng)蛋白的研究報(bào)道不多，尤其是針對(duì)AKI的研究非常少，我們的研究可以認(rèn)為非常有創(chuàng)新性。

通過ELISA方法，我們精確地對(duì)患者血漿和尿液中的肌動(dòng)蛋白進(jìn)行了定量檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明，在為期3 d的隨訪采樣時(shí)間內(nèi)，與健康對(duì)照組相比，膿毒癥患者的血漿肌動(dòng)蛋白水平略有升高，但缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但尿液肌動(dòng)蛋白水平在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均存在顯著差異(P<0.01)。同時(shí)，在膿毒癥患者和saAKI患者之間，我們也發(fā)現(xiàn)了顯著的尿液肌動(dòng)蛋白水平差異(P<0.01)。同時(shí)，尿液肌動(dòng)蛋白與AKI患者的分級(jí)水平也存在顯著相關(guān)性，高分級(jí)的AKI患者顯著具有更高的尿液肌動(dòng)蛋白水平和尿液肌動(dòng)蛋白/肌酐比值(P<0.01)。ROC曲線分析也表明，尿液肌動(dòng)蛋白作為saAKI的診斷指標(biāo)，性能優(yōu)秀(AUC=0.887)。

我們的研究存在部分局限性，由于研究時(shí)間有限，我們連續(xù)招募患者的數(shù)量非常有限，整體樣本量較小。此外，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣的時(shí)間精確性受到了臨床條件的限制，無法完全統(tǒng)一到精確時(shí)間點(diǎn)，在實(shí)際的第1日樣本采集中，時(shí)間間隔稍有變化(大多在12 h內(nèi))，因?yàn)榇蠖鄶?shù)患者是在晚上或下午晚些時(shí)候入院，然后在第2日早上采集第一個(gè)樣本。此外，在我們的研究中，為了控制尿流率的變化，新型尿液AKI生物標(biāo)志物必須歸一到尿肌酐的濃度。然而，越來越多的證據(jù)對(duì)尿肌酐正?；贏KI中的重要性提出了質(zhì)疑，因?yàn)樵贏KI急性發(fā)作的情況下，尿肌酐和其他新型尿液AKI生物標(biāo)志物的排泄率可能受到不同的影響[14-15]。由于肌動(dòng)蛋白在血液循環(huán)中可與凝膠素或Gc-球蛋白結(jié)合，所以正常情況下不會(huì)出現(xiàn)在尿液中。然而，由于嚴(yán)重的腎小球或腎小管損傷，患者尿液中便可以檢測出肌動(dòng)蛋白，所以尿液肌動(dòng)蛋白水平的升高可以提示患者存在嚴(yán)重的腎臟損傷[16]。有研究表明，KIM-1或NGAL是AKI中已知的損傷生物標(biāo)志物，我們的研究表明，尿液肌動(dòng)蛋白可以也可能被歸入這一范疇。目前我們的試驗(yàn)證明，與血清肌酐相比，尿液肌動(dòng)蛋白可能提供有關(guān)腎臟損傷程度的更準(zhǔn)確信息。此外，包括尿液肌動(dòng)蛋白和各種損傷生物標(biāo)志物的多標(biāo)志物聯(lián)合檢測的方法或許能提供與saAKI有關(guān)更準(zhǔn)確的診斷信息。

下一步，我們的研究會(huì)將采樣時(shí)間延長到5～7 d，同時(shí)增加入組患者的數(shù)量，特別是需要腎臟替代治療的患者。并將膿毒癥進(jìn)行進(jìn)一步的分類，以得出更準(zhǔn)確的結(jié)論，并且開展其他不同種類的腎臟疾病(如慢性腎臟病、腎小球腎炎)的患者群體的尿液肌動(dòng)蛋白相關(guān)性研究。我們的試驗(yàn)?zāi)壳耙呀?jīng)證明了ELISA的方法用于尿液肌動(dòng)蛋白的檢測是準(zhǔn)確、有效和及時(shí)的，在進(jìn)一步的研究中，我們還將對(duì)其他的檢測方法，例如定量熒光法進(jìn)行嘗試，力圖找到最適合該生物標(biāo)志物的檢測手段。

綜上所述，在saAKI中，尿液肌動(dòng)蛋白可作為酸性肌酐的補(bǔ)充診斷生物標(biāo)志物，而較高的尿液肌動(dòng)蛋白水平也可以準(zhǔn)確地反映AKI的嚴(yán)重程度。尿液肌動(dòng)蛋白水平作為針對(duì)膿毒血癥相關(guān)AKI的診斷指標(biāo)，效果顯著，值得進(jìn)一步深入研究。