王宇浩，張思敏，李健楠，董海龍

(1陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710032)

隔核位于大腦中線區(qū)域，是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分[1-2]。根據(jù)位置、神經(jīng)元組成和環(huán)路連接的不同可將隔核分為內(nèi)側(cè)隔核和外側(cè)隔核[3]。其中內(nèi)側(cè)隔核被認(rèn)為主要由谷氨酸神經(jīng)元組成，投射至海馬組成隔核-海馬通路，參與記憶的形成和儲(chǔ)存[4-5]。而外側(cè)隔核主要由γ-氨基丁酸能(gamma-aminobutyric acid-ergic，GABAergic)抑制性神經(jīng)元組成，這些神經(jīng)元接受海馬的投射，并向外側(cè)下丘腦、腹側(cè)被蓋區(qū)等腦區(qū)發(fā)出神經(jīng)傳出[6-7]。研究表明，外側(cè)隔核參與多種神經(jīng)功能的調(diào)控，例如，外側(cè)隔核接受海馬的神經(jīng)傳入從而參與學(xué)習(xí)記憶[8-9]；外側(cè)隔核可通過對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺素軸產(chǎn)生影響調(diào)控應(yīng)激行為[10]；并且，其與腹側(cè)被蓋區(qū)存在神經(jīng)連接，從而參與獎(jiǎng)賞反饋等[11]。除此之外，近年來的研究認(rèn)為外側(cè)隔核參與多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。全麻藥物作用機(jī)制相關(guān)的研究表明，外側(cè)隔核的GABAergic神經(jīng)元具有覺醒活性，激活這類神經(jīng)元能夠促進(jìn)小鼠從睡眠和異氟醚麻醉中覺醒，其中的機(jī)制是通過抑制腹側(cè)被蓋區(qū)GABAergic神經(jīng)元，進(jìn)一步去抑制腹側(cè)被蓋區(qū)內(nèi)覺醒活性神經(jīng)元，從而產(chǎn)生覺醒效應(yīng)[13]。

根據(jù)解剖學(xué)和神經(jīng)元組成的不同，外側(cè)隔核可分為背側(cè)部(dorsal part of the lateral septal nucleus，LSD)、中間部以及腹側(cè)部。其中，LSD表達(dá)大量生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SOM)陽(yáng)性神經(jīng)元，中間部主要包含腦啡肽陽(yáng)性神經(jīng)元，而腹側(cè)部主要由表達(dá)雌激素受體的神經(jīng)元組成[14-15]。目前，尚缺少LSD內(nèi)SOM神經(jīng)元的傳出投射及其在麻醉時(shí)的活性變化的相關(guān)研究。本研究擬利用順向病毒示蹤技術(shù)，觀察LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元的神經(jīng)傳出，并利用鈣信號(hào)記錄與分析技術(shù)，觀察LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元的活性在異氟醚麻醉-覺醒中的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SOM-Cre小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，引進(jìn)后在空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)基因動(dòng)物飼養(yǎng)中心SPF條件下飼養(yǎng)和繁育。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±1)℃，濕度(40±2)%。晝夜節(jié)律為7∶00～19∶00亮燈。允許小鼠自由攝取水和食物以及自由活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)[許可證號(hào)：SYXK(軍)2017-0044]。

1.1.2 主要儀器和試劑 順向示蹤病毒AAV2/9-Ef1α-DIO-mCherry和鈣信號(hào)病毒AAV2/9-Ef1α-DIO-GCaMP6s購(gòu)自武漢Brain-VTA公司，PBS緩沖液購(gòu)自中國(guó)鑫泰公司，光纖購(gòu)自杭州Inper公司，鈣信號(hào)記錄分析系統(tǒng)(QAXK-FPS-DC-LED)購(gòu)自南京千奧星科公司，立體定位儀(REP185-002)、小動(dòng)物麻醉機(jī)(HSIV-130123061)及異氟醚揮發(fā)罐(SN4828)購(gòu)自深圳瑞沃德公司，病毒注射器(MO-10)及小動(dòng)物顱骨鉆孔機(jī)(NE120)購(gòu)自日本NSK公司，激光共聚焦顯微鏡(FV1000)及全玻片掃描系統(tǒng)購(gòu)自日本Olympus公司，冰凍切片機(jī)(CM1900)購(gòu)自日本LEICA公司。

1.2 方法

1.2.1 順向示蹤病毒的注射 雄性SOM-Cre小鼠6只，在14 mL/L異氟醚麻醉下，被固定于立體定位儀上。用絡(luò)合碘消毒液消毒后剪開小鼠頭皮暴露顱骨，充分清晰暴露前囟和人字點(diǎn)。調(diào)平顱骨平面后，根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜，將200 nL的AAV2/9-Ef1α-DIO-mCherry病毒以50 nL/min的速度注射到小鼠的右側(cè)LSD(AP：1.0 mm，ML：0.4 mm，DV：-3.2 mm)。注射完畢后，留置注射針10 min，以局限病毒擴(kuò)散范圍。手術(shù)結(jié)束后，用牙科膠封閉顱骨避免感染。

1.2.2 全腦切片制備和全玻片掃描成像 順向示蹤病毒表達(dá)3周后，將小鼠用20 mL/L異氟醚深度麻醉，開胸經(jīng)心臟先后灌注生理鹽水20 mL和40 g/L多聚甲醛20 mL。灌注完畢后斷頭取腦，經(jīng)后固定2 h后，置入300 g/L蔗糖溶液中充分脫水。后將小鼠腦組織冰凍切片，切取厚度為40 μm的全腦冠狀切片，并按照順序每切3張腦片留取其中1張。留存的腦片經(jīng)每次15 min、共3次的PBS緩沖液沖洗后貼片，備熒光顯色全玻片掃描成像。

進(jìn)行熒光顯色全玻片掃描成像時(shí)，調(diào)整激發(fā)光參數(shù)，激發(fā)紅色熒光表達(dá)。充分對(duì)焦每張腦片后，進(jìn)行全玻片掃描成像，供后續(xù)分析。

1.2.3 鈣信號(hào)記錄小鼠模型制作 雄性SOM-Cre小鼠8只，其中6只小鼠病毒表達(dá)和光纖位置良好。因此，將另外2只鈣信號(hào)小鼠模型的數(shù)據(jù)剔除，對(duì)余下的鈣信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在14 mL/L異氟醚平穩(wěn)麻醉下，將200 nL的AAV2/9-Ef1α-DIO-GCaMP6s病毒，以50 nL/min的速度注射到小鼠的LSD。注射完畢后，留置注射針10 min，以局限病毒擴(kuò)散范圍。然后將光纖植入注射部位的上方，用牙科膠將光纖和顱骨粘合封閉。術(shù)后小鼠恢復(fù)3周。

1.2.4 鈣信號(hào)記錄與分析 鈣信號(hào)小鼠模型手術(shù)恢復(fù)3周后，將光纖使用跳線連接到鈣信號(hào)采集系統(tǒng)上。鈣信號(hào)采集系統(tǒng)采用488 nm和590 nm參比的雙激光系統(tǒng)，度量GCaMP6s的熒光變化。實(shí)驗(yàn)開始前將光纖尖端的激光強(qiáng)度調(diào)節(jié)為30～40 μW，經(jīng)過200 s的信號(hào)校準(zhǔn)后，分別記錄清醒基線10 min、14 mL/L異氟醚麻醉吸入30 min以及麻醉后恢復(fù)20 min，供后續(xù)分析。并且，記錄異氟醚麻醉誘導(dǎo)小鼠失去翻正反射，即意識(shí)消失的時(shí)間，以及停止異氟醚吸入后小鼠恢復(fù)翻正反射，即意識(shí)恢復(fù)的時(shí)間[13]。計(jì)算鈣信號(hào)記錄過程中實(shí)時(shí)鈣信號(hào)強(qiáng)度的變化：平均delta F/F=(F-F0)/F0×100，其中F是鈣信號(hào)強(qiáng)度，F(xiàn)0是基線熒光強(qiáng)度[16]。

2 結(jié)果

2.1 LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元投射到多個(gè)腦區(qū)

對(duì)6只動(dòng)物的全玻片掃描分析發(fā)現(xiàn)，有3只動(dòng)物的病毒注射和表達(dá)位置準(zhǔn)確。神經(jīng)元特異性順向示蹤病毒AAV2/9-Ef1α-DIO-mCherry被準(zhǔn)確地注射至SOM-Cre小鼠的LSD。通過顯微鏡觀察可知，紅色熒光DIO-mCherry表達(dá)良好并局限在右側(cè)LSD(圖1A)。對(duì)神經(jīng)元末梢的DIO-mCherry病毒表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元主要向前扣帶回(25區(qū))(圖1B)、外側(cè)隔核腹側(cè)部(圖1C)、前下丘腦核(圖1D)、外側(cè)下丘腦(圖1E)、腹側(cè)被蓋區(qū)(圖1F)發(fā)出密集神經(jīng)纖維投射，向中縫背核(圖1G)、藍(lán)斑(圖1H)也有神經(jīng)纖維投射。這些結(jié)果表明，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元支配腦內(nèi)多個(gè)腦區(qū)，因此其可能通過調(diào)控上述下游腦區(qū)參與調(diào)控應(yīng)激、覺醒、獎(jiǎng)賞反饋、情感等神經(jīng)生理效應(yīng)。

A：SOM-Cre小鼠LSD注射順向示蹤病毒；B：前囟前1.53 mm神經(jīng)元末梢DIO-mCherry病毒表達(dá)；C：前囟前0.37 mm神經(jīng)元末梢DIO-mCherry病毒表達(dá)；D：前囟后0.35 mm神經(jīng)元末梢DIO-mCherry病毒表達(dá)；E：前囟后1.91 mm神經(jīng)元末梢DIO-mCherry病毒表達(dá)；F：前囟后3.16 mm神經(jīng)元末梢DIO-mCherry病毒表達(dá)；G：前囟后4.47 mm神經(jīng)元末梢DIO-mCherry病毒表達(dá)；H：前囟后5.63 mm神經(jīng)元末梢DIO-mCherry病毒表達(dá)。LSD：背側(cè)部；ACC：前扣帶回；MS：內(nèi)側(cè)隔核；LV：側(cè)腦室；LSI：外側(cè)隔核內(nèi)側(cè)部；LSV：外側(cè)隔核腹側(cè)部；NAc：伏隔核；Cpu：紋狀體；LPO：外側(cè)視前區(qū)；AH：前下丘腦核；LH：外側(cè)下丘腦；VTA：腹側(cè)被蓋區(qū)；DRN：中縫背核；DRV：中縫背核腹側(cè)部；LC：藍(lán)斑。圖1 LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元向下游投射示蹤

2.2 LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元參與異氟醚麻醉覺醒進(jìn)程

異氟醚麻醉-覺醒進(jìn)程鈣信號(hào)記錄結(jié)束后，對(duì)6只病毒表達(dá)和光纖位置良好(圖2A～C)的小鼠模型進(jìn)行鈣信號(hào)數(shù)據(jù)分析。LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元的鈣信號(hào)活動(dòng)在清醒基線較高，能被異氟醚麻醉減弱，并且在麻醉后恢復(fù)(圖2D、G)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，清醒、異氟醚麻醉、麻醉后覺醒3個(gè)階段的平均delta F/F值差異明顯，其中清醒階段顯著高于異氟醚麻醉階段(P<0.01，圖2J)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元的鈣信號(hào)活動(dòng)在意識(shí)消失時(shí)顯著下降(圖2E、H)，意識(shí)消失后的平均delta F/F值顯著低于意識(shí)消失前(P<0.05，圖2K)。在意識(shí)恢復(fù)時(shí)，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元的鈣信號(hào)活動(dòng)顯著增加(圖2F、I)，意識(shí)恢復(fù)后的平均delta F/F值顯著高于意識(shí)恢復(fù)前(P<0.05，圖2L)。這些結(jié)果表明，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元在全麻-覺醒中被麻醉抑制，并且在意識(shí)消失和恢復(fù)過程中發(fā)生了顯著改變。

A：觀察LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)小鼠模型制作示例圖；B：異氟醚麻醉-覺醒過程鈣信號(hào)記錄系統(tǒng)示例圖；C：LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)病毒表達(dá)情況；D：異氟醚麻醉-覺醒過程中，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)變化曲線圖異氟醚誘導(dǎo)意識(shí)消失過程中，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)變化曲線圖異氟醚麻醉后意識(shí)恢復(fù)過程中，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)變化曲線圖異氟醚麻醉-覺醒過程中，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)變化時(shí)間光柵圖；H：異氟醚誘導(dǎo)意識(shí)消失過程中，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)變化時(shí)間光柵圖；I：異氟醚麻醉后意識(shí)恢復(fù)過程中，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)變化時(shí)間光柵圖；J：異氟醚麻醉-覺醒過程中，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)變化統(tǒng)計(jì)圖；K：異氟醚誘導(dǎo)意識(shí)消失過程中，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)變化統(tǒng)計(jì)圖；L：異氟醚麻醉后意識(shí)恢復(fù)過程中，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)變化統(tǒng)計(jì)圖。LSD：背側(cè)部；SOM：生長(zhǎng)抑素。 aP<0.05， bP<0.01。圖2 異氟醚麻醉-覺醒過程中LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)變化

3 討論

本研究通過神經(jīng)元特異性順向病毒示蹤的方法，觀察展示了LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元的神經(jīng)傳出，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要向下丘腦、中腦等覺醒相關(guān)核團(tuán)投射，提示其具有調(diào)控全麻-覺醒進(jìn)程的可能。進(jìn)一步通過神經(jīng)元特異性鈣信號(hào)記錄與分析的方法，證實(shí)了LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元的活性在異氟醚麻醉期間被抑制，并且其神經(jīng)元活性在意識(shí)消失過程中顯著下降，在意識(shí)恢復(fù)過程中顯著上升。這些結(jié)果展示了LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元的下游投射分布，并證實(shí)了其活性變化與異氟醚麻醉-覺醒過程相關(guān)。

既往研究證實(shí)，外側(cè)隔核中90%以上的神經(jīng)元為GABAergic抑制性神經(jīng)元，而SOM陽(yáng)性神經(jīng)元主要存在于LSD[7]。LSD主要接受海馬CA3的神經(jīng)傳入，并向下丘腦等區(qū)域投射[14-15]。但這些研究缺乏系統(tǒng)性或神經(jīng)元特異性。本研究的順向示蹤結(jié)果證實(shí)LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元主要向下丘腦外側(cè)區(qū)、腹側(cè)被蓋區(qū)等覺醒相關(guān)核團(tuán)發(fā)出密集神經(jīng)投射，提示其可能在全麻-覺醒和睡眠-覺醒中發(fā)揮調(diào)控作用。全麻藥物相關(guān)的研究證實(shí)，外側(cè)隔核內(nèi)GABAergic陽(yáng)性神經(jīng)元能夠通過抑制腹側(cè)被蓋區(qū)GABAergic抑制性神經(jīng)元，進(jìn)一步去抑制該核團(tuán)內(nèi)覺醒陽(yáng)性神經(jīng)元，從而促進(jìn)小鼠從全麻和睡眠中覺醒[13]。該研究主要調(diào)控LSD和外側(cè)隔核中間部的GABAergic陽(yáng)性神經(jīng)元，而本研究將范圍局限在LSD內(nèi)的SOM神經(jīng)元。已有研究表明LSD內(nèi)的SOM神經(jīng)元調(diào)控恐懼反應(yīng)[14]，提示其在意識(shí)調(diào)控中有重要作用，我們通過鈣信號(hào)記錄與分析，證實(shí)了其活性在異氟醚麻醉-覺醒過程中發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化，并且在意識(shí)消失過程中顯著下降和在意識(shí)恢復(fù)過程中顯著上升。結(jié)合順向病毒示蹤和鈣信號(hào)的結(jié)果我們認(rèn)為，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元可能通過調(diào)控下丘腦外側(cè)區(qū)、腹側(cè)被蓋區(qū)等覺醒相關(guān)核團(tuán)從而促進(jìn)覺醒。SOM陽(yáng)性神經(jīng)元被認(rèn)為是GABAergic抑制性神經(jīng)元，而抑制性神經(jīng)元促進(jìn)覺醒的機(jī)制可分為去抑制興奮性神經(jīng)元[13]以及前饋抑制促進(jìn)睡眠的抑制性神經(jīng)元[17]。因此，LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元發(fā)出神經(jīng)投射至上述核團(tuán)內(nèi)何種類型的神經(jīng)元，以及是通過“去抑制”還是“前饋抑制”的作用調(diào)控不同核團(tuán)促進(jìn)覺醒，其神經(jīng)環(huán)路機(jī)制仍需進(jìn)一步探索研究。

綜上所述，本研究較為系統(tǒng)地展示了LSD內(nèi)SOM陽(yáng)性神經(jīng)元的神經(jīng)傳出投射，并證實(shí)了其參與全麻-覺醒調(diào)控的作用，為接下來研究其調(diào)控覺醒以及覺醒相關(guān)行為的機(jī)制提供了相關(guān)證據(jù)。