李臘梅，楊 晶，劉苑瑩，史云欣，胡文超，解柔剛，姜 鳴

(1延安大學生命科學學院多肽資源藥物研究中心，陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術研究中心，陜西 延安 716099；空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院：2神經生物學教研室，4學員六大隊，陜西 西安 710032；3西安國際醫(yī)學中心心臟病醫(yī)院，陜西 西安 710109)

三叉神經節(jié)(trigeminal ganglion，TRG)位于顱中窩顳骨巖部尖端前側的三叉神經壓跡處，參與口面部區(qū)域的各種感覺功能，如非傷害性或傷害性機械、熱和化學刺激[1-2]。病理條件下TRG神經元的超興奮是三叉神經痛的重要原因[3]， TRG神經元中分子的表達變化以及生理特性變化被認為與三叉神經損傷或炎癥相關的口面部感覺功能障礙有關[4]。感覺神經節(jié)的神經元按照基因表達可進行更為細致的分類[5]。不同形態(tài)的細胞類型往往表現出獨特的電生理特性。根據TRG小神經元[6]、大鼠三叉神經中腦核神經元[7-8]、大鼠背根神經節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)大細胞[9]的興奮性特征進行分類，其主要類型為3類神經元(激活閾值較高)。然而，不同放電類型的神經元是否具有特殊的基因表達譜仍不清楚。因此，研究感覺神經元的放電模式與其基因表達關系，是研究神經功能的重要環(huán)節(jié)。

單細胞轉錄組測序(single cell RNA sequencing，scRNA-seq)技術是在單個細胞水平上，對轉錄組進行擴增與測序分析的一項技術，對于檢測低豐度轉錄本和發(fā)現新轉錄本具有其獨特的優(yōu)勢[10]。通過定量分析單個細胞和不同細胞類型之間的分子和細胞變化將有助于尋找疼痛療法的潛在靶點[11]。目前，新出現的一項結合全細胞膜片鉗記錄和單細胞RNA測序的“Patch-seq”技術[12-13]，具有在單細胞水平上將基因表達與神經功能聯系起來的獨特優(yōu)勢。本研究通過對小鼠TRG神經元的放電特征記錄，并對特定放電模式的神經元細胞進行scRNA-seq，構建了小鼠TRG神經元的Patch-seq技術方法，進一步分析小鼠TRG神經元細胞放電模式及主要離子通道相關基因的表達分布，為進一步研究頭面部初級感覺傳入的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用4～6周齡健康小鼠，雌雄不限，由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，動物單籠飼養(yǎng)，晝夜節(jié)律為12 h光/12 h暗循環(huán)，室溫為25 ℃左右，自由攝食飲水。所有操作和動物處理遵循空軍軍醫(yī)大學實驗動物福利與倫理委員會制定的指導原則(許可證號：20210456)，盡量使動物的痛苦最小化，減少動物使用數量。

1.1.2 試劑 NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、MgCl2、KOH、NaHCO3、葡萄糖、K-Glu、NaH2PO4、NaOH、EGTA、Mg-ATP和HEPES均購自美國Sigma公司。

1.1.3 儀器 Axon Multiclmap 700B膜片鉗放大器；AxonTMDigidata? 1550B數模轉換器，正置紅外微分干涉顯微鏡(BX51，Olympus，日本)；P-97玻璃微電極拉制儀(Sutter Instrument Company，美國)；萬分之一天平(Sartorius，德國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗溶液及物品準備 麻醉用10 g/L戊巴比妥鈉溶液：1 g戊巴比妥鈉溶解于100 mL生理鹽水中。配置人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)(g/L)：NaCl 7.43，KCl 0.27，NaH2PO40.14，MgSO40.16，CaCl20.27，NaHCO32.18，葡萄糖2.73。用0.04 g/L NaOH或90 mL/L HCl調pH值為7.4(22～24 ℃)。ACSF每次使用前充950 mL/L O2及50 mL/L CO2的混合氣飽和0.5～1 h。電極內液(g/L)：KCl 1.34，K-Glu 30.91，CaCl20.15，MgCl20.41，EGTA 0.42，HEPES 2.4，Mg-ATP 2.5，用0.04 g/L NaOH或90 mL/L HCl調pH值為7.4，滲透壓調至280～290 Osm/L。實驗用手術器械、燒杯、燒瓶、培養(yǎng)皿、玻璃電極管和ACSF等進行高壓蒸汽滅菌(120 ℃，15 min)。

1.2.2 TRG標本制備 小鼠(4～6周齡)腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉麻醉后，斷頭剪開頭部毛皮，從顱骨兩側剪開暴露腦子，輕輕將大、小腦剝離，可見顱底一對白色的平行排列的有分叉的組織團即為TRG，在預冷的氧飽和ACSF中剔除神經節(jié)周圍的血管、脂肪和神經鞘膜等結締組織后，呈乳白色。將組織塊放入2 mL消化酶中(消化酶制備：1 mg蛋白酶和1.6 mg膠原酶用ACSF稀釋至2 mL)，于37 ℃恒溫水浴中消化30 min。取出組織塊，室溫下放入氧飽和ACSF中，孵育1～2 h后開始試驗。與細胞培養(yǎng)方法相比，對神經元的損傷較小，極大地保存了記錄神經元的基本特性。

1.2.3 膜片鉗記錄神經元興奮性特征 實驗在正置紅外微分干涉顯微鏡下進行，將孵育好的TRG整節(jié)移至記錄用灌流槽內，用黏有平行細尼龍絲的“U”形鉑絲固定神經節(jié)。灌流槽置于顯微鏡載物臺上，在5倍物鏡下觀察TRG神經元細胞的分布，40倍物鏡下觀察并選擇細胞進行可視封接。通過紅外微分干涉顯微鏡觀察發(fā)現，狀態(tài)較好的神經元輪廓清晰、表面光滑、看似有彈性，玻璃微電極尖端正壓壓在表面很容易出現凹陷，并可恢復。而狀態(tài)較差的神經元則輪廓模糊不清、表面皺縮或者腫脹、對比度透亮并可見到細胞核，電極尖端正壓壓在表面不易出現凹陷。封接用微電極為薄壁有芯軟質玻璃毛坯，經P-97拉制而成，充灌電極內液入水電阻為5～8 MΩ。用微操縱儀控制記錄電極尖端接近所選神經元， 在電極接近細胞的過程中，向微電極內施加正壓，以防止電極尖端堵塞。在低倍鏡下找到電極尖端，并緩慢將電極下降接近TRG組織，轉換到高倍物鏡下，將電極尖端緩慢調節(jié)到所要鉗制的細胞上方。緩慢下降微電極，當電極尖端接觸細胞表面時，正壓會使細胞表面出現一個小凹，同時從Seal Test上顯示封接電阻增加0.1～0.2 MΩ。此時撤去正壓，并給予一定的負壓，緩慢將鉗制電壓逐漸調至-60 mV，使其形成巨阻封接。以上步驟成功后采用脈沖短促負壓吸引進行破膜，形成全細胞模式。在電流鉗狀態(tài)下記錄神經元興奮性特征，選擇靜息電位<-50 mV、動作電位超射>20 mV的神經元進行下一步的實驗。

1.2.4 單細胞樣本獲取 不同于傳統腦片“Patch-seq”技術，TRG神經元直徑較大，用記錄電極直接拉取細胞失敗率較高，需要更換口徑較粗的電極，電極入水電阻為2～4 MΩ，進行二次鉗制以拉取細胞，可增加成功率。以同樣的方法用微操縱儀控制電極尖端接近1.2.3中記錄完神經元放電特征的神經元，此時只需用較大的負壓將細胞牢牢吸引住，然后用微操縱儀緩慢移動電極，將電極吸引的細胞從神經節(jié)上拉下來，期間可再次給負壓以吸引住細胞，防止電極移動過程中細胞掉落。用微操縱儀控制電極出灌流槽子液面時速度需非常緩慢，防止出液面時細胞掉落。之后，迅速取下電極，將玻璃微電極尖端輕輕折斷進入裝有裂解液的低吸附管中，做好標記，-80 ℃冰箱凍存，供下一步進行scRNA-seq實驗。實驗過程中要求實驗人員應戴口罩、手套，實驗器械、器皿和玻璃電極應提前滅菌消毒，實驗操作過程中避免說話，細胞取出過程應迅速，細胞脫離組織后應立即放入裂解液，防止RNA降解。

1.2.5 樣本文庫構建與質檢 將1.2.4中獲取的單細胞樣本，經SMART-Seq?HT Kit放大后得到cDNA，對cDNA進行片段化、末端修復、3′末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構建。經Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, 美國)質檢合格后備用。

1.2.6 測序實驗 使用Illumina NovaSeq 6000測序儀，選用PE150模式進行測序。測序質控標準為每向堿基質量大于20(Q20)的比例≥85%。

1.2.7 測序數據分析 對測序結果進行GO分析。首先，對生物過程、細胞成分、分子功能三個層次上對應的樣本表達基因數目進行統計，將統計結果用柱狀圖展示。將所挑選的基因向GO數據庫的各個條目映射，計算每個條目的基因數目，然后應用超幾何檢驗，與整個基因組背景相比，篩選所表達基因中顯著富集的GO條目，以散點圖的方式展示富集程度排名前30的GO條目。對各個通路上的表達基因數目進行KEGG統計，將統計結果用柱狀圖展示。與GO富集相同進行KEGG富集分析，以散點圖的方式展示富集程度排名前30的KEGG通路。

2 結果

2.1 小鼠TRG的取材和TRG神經元細胞的分布

小鼠經腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉麻醉，斷頭后剪開頭部毛皮，暴露并剝離腦后，可見顱底一對白色平行排列的有分叉的組織團即為TRG(圖1A)。在預冷的氧飽和ACSF中剔除TRG周圍的血管、脂肪、神經鞘膜等結締組織后，可成功分離出乳白色的TRG，其神經元細胞分布位置如圖1B。在正置紅外微分干涉顯微鏡物鏡下可觀察到透明串狀分布的TRG神經元細胞(圖1C)。

A：小鼠TRG圖；B：小鼠TRG神經元細胞分布位置；C：顯微鏡下小鼠TRG神經元細胞圖(×5)。紅色虛線標記為TRG神經元細胞。TRG：三叉神經節(jié)。圖1 小鼠TRG神經元分布

2.2 膜片鉗記錄TRG神經元的興奮性

對TRG神經元進行全細胞膜片鉗記錄(圖2A)，進行電流鉗記錄時，選擇靜息膜電位<-50 mV、動作電位超射>20 mV的神經元進行記錄。主要記錄TRG中大型細胞，其放電特征為：給予方波刺激時只產生單個動作電位，誘發(fā)動作電位的基強度較高[(800.00±129.10) pA)](圖2B)，圖2C顯示了神經元放電個數與注入電流強度之間的關系。當給予斜波刺激時，神經元在注入很大電流(1 500 pA)的情況下，也不能產生動作電位(圖2D)。以往對DRG大神經元興奮性分型研究中，對注入去極化方波刺激只能產生單個動作電位，且斜波刺激不能誘發(fā)出動作電位的神經元稱為3類神經元[9]。本研究在TRG上記錄到的該種放電模式的神經元即為3類神經元，其所占比例為73%(35/48)。該類興奮性神經元的膜特性及動作電位特征為靜息膜電位為(-61.09±2.10)mV，膜電容為(63.07±10.99)pF，膜電阻為(48.20±20.10)MΩ，動作電位幅值為(94.43±15.30)mV，動作電位閾電位為(-32.06±2.94)mV，動作電位半寬為(2.05±0.80)ms，基強度為(800.00±129.10)pA。

A：顯微鏡下TRG神經元(×40)；B：去極化方波刺激只產生一個動作電位；C：刺激電流強度與放電個數的關系；D：斜波刺激不能誘發(fā)出動作電位。TRG：三叉神經節(jié)。圖2 TRG中大型3類神經元放電特征

2.3 神經元興奮性記錄完成后神經元細胞的獲取和收集

興奮性記錄完成后神經元細胞的獲取過程如圖3所示，用口徑較粗(入水電阻：2～4 MΩ)的玻璃電極，進行二次鉗制，此時需用較大的負壓將細胞吸引住(圖3A)，緩慢移動電極，將細胞從TRG上拉下來(圖3B～D)。之后，迅速取下電極，將玻璃微電極尖端輕輕折斷進入裝有裂解液的低吸附管中(吸附管需置于冰塊中)，供下一步進行scRNA-seq實驗。

A：玻璃微電極吸引細胞；B～D：緩慢移動玻璃微電極將細胞拉取出來。圖3 Patch-seq技術獲取神經元的過程

2.4 SMART-Seq構建文庫和測序質檢

將2.3中收集的單細胞樣本經SMART-Seq?HT Kit放大后得到cDNA，對cDNA進行片段化、末端修復、3′ 末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構建。采用Agilent Bioanalyzer 2100 檢測文庫大小，主峰在300 bp左右(圖4)，說明mRNA的完整性好。測序數據質控結果Q20為96.57%，滿足測序質控要求(>85%)。所構建文庫可以進行上機測序，說明通過膜片鉗玻璃微電極獲取單個細胞的技術方法是成功的，可以獲得高質量的細胞進行scRNA-seq。

圖4 Agilent Bioanalyzer 2100檢測文庫大小結果

2.5 測序序列質量評估

質檢合格的樣本進行上機測序，樣本采用雙端測序，雙端測序質量評估結果均合格。測序序列質量評估Q值盒圖中90%的質量值為高質量數值(圖5A)，且GC和AT堿基對均衡分布(圖5B)，每條序列的測序質量主要集中在30～40中(圖5C)，說明樣本測序質量較好，測序序列長度為151 bp，且151 bp是主要的(圖5D)，說明測序結果優(yōu)良。

A：Q值盒圖統計，上下的黑線代表占90%和10%對應的堿基質量值，藍線表示質量數值的平均值、綠色背景部分代表高質量數值部分、橘色背景部分代表合理質量數值部分、紅色背景部分代表低質量數值部分；B：堿基分布圖；C：序列質量評分分布圖；D：序列長度分布圖。圖5 測序序列質量評估方法

2.6 測序基因表達分析

測序分析共檢測了34 746種基因，在上述放電模式的TRG神經元細胞檢測到17 057種基因。根據該類TRG神經元細胞中表達的基因數目進行GO分析，圖6A展示了樣本表達基因數的富集情況，主要富集在細胞過程、細胞組分和分子結合等通路。圖6B為最顯著的30條GO富集通路，其主要與tRNA加工、剪接前體和非甲基化CpG結合等功能有關。另外，進行KEGG分析，其主要富集在全局和總覽圖、內分泌系統、癌癥概述、信號轉導以及運輸和分解代謝等通路(圖6C)。圖6D為最顯著的30條KEGG富集通路，主要與泛素介導的蛋白水解、剪接體、內質網蛋白加工等功能相關。進一步分析該放電類型的TRG神經元中的Na+通道和K+通道相關基因(SCN和KCN)，發(fā)現二者比例無顯著差異(圖6E)。然而，在該放電類型神經元中，Na+通道的亞型分布比例有其顯著的特征，其中編碼Na+通道β1亞型(NaVβ1)的基因SCN1B占主導，比例為53.6%。而與疼痛相關的Na+通道α亞型中編碼NaX通道的SCN7A基因占比最高，為12.3%，NaV1.7、NaV1.8和NaV1.9通道對應的編碼基因SCN9A、SCN10A和SCN11A則分別占比為2.3%、8.4%和4.4%(圖6F)。在K+通道的亞型分布中，與抑制疼痛相關的基因KCNIP3占主導，比例為25.4%，另外與調節(jié)神經元興奮性相關的KV1.2、KVβ2、KV3.4和KV7.4通道對應的編碼基因KCNA2、KCNAB2、KCNC4和KCNQ4分別占比為2.7%、5.6%、3.3%、5.4%(圖6G)。

A：GO富集分析柱狀圖，橫坐標表示表達基因數目，縱坐標表示不同的GO術語；B：GO富集分析散點圖，縱坐標表示不同的GO術語，橫坐標表示注釋到某條GO術語的富集程度；C：KEGG富集分析柱狀圖，橫坐標表示表達基因數目，縱坐標表示不同的KEGG通路；D：KEGG富集分析散點圖，縱坐標表示不同的KEGG通路，橫坐標表示注釋到某條KEGG通路的富集程度；E：Na+和K+通道基因表達分布；F：Na+通道SCN基因表達分布；G：K+通道KCN基因表達分布。圖6 基因表達分布

3 討論

TRG是頭面部感覺傳入的中轉站。在正常生理條件下，TRG神經元僅僅對外周信息進行忠實傳導，不產生或只產生極少的自發(fā)放電。而在許多神經病理痛模型中，初級感覺神經元往往會產生異位自發(fā)放電，這些自發(fā)放電成為動物自發(fā)痛、觸誘發(fā)痛及痛覺過敏等異常痛行為的起源[14]。

感覺神經元與興奮性關系最為密切的通道是Na+通道。電壓門控型Na+通道是一個龐大的家族，按照其α亞基的不同可分為不同亞型，主要為NaV1.1～NaV1.9以及NaX，別名分別為Rat I/HBSCI、Rat II/HBSCII、Rat III、SkM1/μ1、SkM2/H1、NaCh6/PN4、PN1/NaS/hNE、SNS/PN3、NaN/SNS2/PN5和NaG。其中有四種Na+通道為DRG或TRG神經元所特有，分別是NaV1.7、NaV1.8、NaV1.9和NaX。NaV1.7是一種在外周神經系統高表達的Na+通道，同時表達于所有的背根節(jié)神經元，它編碼一種具有較低的激活閾值和較快的通道活性特性的、TTX敏感的Na+通道，可能參與神經元動作電位的形成[15]；NaV1.8主要在背根節(jié)小細胞及TRG神經元中表達,其是一種去極化激活的電壓敏感Na+通道，有較高的激活閾值及快速激活、緩慢失活的動力學特性，對高濃度TTX不敏感[16]；NaV1.9主要在DRG小細胞和TRG神經元中表達，具有較低的激活閾值和相對較快的失活速度[17]。對初級感覺神經元興奮性的研究有助于我們了解神經元對外界感受刺激的響應模式，進而闡明在生理和病理條件下的神經功能變化。因此，結合細胞基因表達譜以及神經元功能的方法將深入擴展以上的研究。

在本研究中，我們通過全細胞膜片記錄到73%(35/48)的TRG興奮性神經元的放電模式為“忠實傳導”式神經元，在方波刺激條件下只產生單個動作電位，并且基強度較高[(800.00±129.10)pA]，而給予斜波刺激時，神經元在注入很大電流的情況下(>1500 pA)，也不能產生動作電位。針對該種放電特征的TRG神經元，用膜片鉗記錄的玻璃微電極吸取并收集進行scRNA-seq。采用SMART-Seq?HT Kit放大后得到的cDNA，經Agilent Bioanalyzer 2100質檢驗證所獲得的細胞樣本合格，可滿足測序樣本量的要求。進一步的測序質量評估顯示測序結果優(yōu)良。以上結果提示對小鼠TRG神經元的Patch-seq技術方法的成功建立。

進一步測序分析，對上述放電模式的TRG神經元細胞中表達的基因進行了GO功能分析和KEGG通路分析。另外，對該放電類型的TRG神經元中與Na+通道和K+通道相關的基因的亞型分析顯示，編碼Na+通道β1亞型(NaVβ1)的基因SCN1B占比最高，為53.6%，該基因缺失，神經元存在持續(xù)性內向鈉電流，興奮性會增加。在Na+通道α亞型中NaX作為一種Na+濃度感受器，其編碼基因SCN7A占比最高為12.3%，而NaV1.7的編碼基因SCN9A占比為2.3%，NaV1.8的編碼基因SCN10A占比為8.4%，NaV1.9的編碼基因SCN11A占比為4.4%。表明在該類型細胞中NaV1.7通道占比較低，NaV1.7作為一種神經元放電的起搏點，會使神經元產生串放電[18]。在K+通道中，KCNIP3基因占比最高為25.4%，該基因被認為是疼痛產生過程中的一種關鍵轉錄抑制子[19]。然而，需要對病理狀態(tài)下的神經元進行Patch-seq分析比較，才能夠進一步分析在病理狀態(tài)下神經元興奮性改變與基因圖譜變化之間的關系，為進一步理解疾病狀態(tài)，尋找疾病治療的靶點提供依據。