武鑫玥，李紅穎，謝雨宸，彭芳，丁銀，張靜▲，范剛▲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

1 實驗材料與設(shè)備

1.1 實驗藥材

本研究共收集27批水柏枝藥材，經(jīng)重慶市中藥研究院秦松云教授鑒定為檉柳科植物具鱗水柏枝M.squamosa、秀麗水柏枝M.elegans、三春水柏枝M.paniculata、小花水柏枝M.wardii的干燥枝、葉(見表1)。

表1 樣品信息

1.2 試劑

槲皮素對照品(純度≥98%，批號：AF20032451，成都埃法生物科技有限公司)，磷酸(批號：2020060101色譜純，四川科隆化學(xué)試劑廠)，甲醇(批號：WXBD6985V，色譜純，美國SIGMA公司)，乙腈(批號：WXBD5457V，色譜純，美國SIGMA公司)，乙醇(批號：2020120501，分析純，四川科隆化學(xué)試劑廠)、鹽酸(批號：2018080801，分析純，四川科隆化學(xué)試劑廠)。

1.3 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9023A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，高溫電阻爐(KSW，沈陽市節(jié)能電爐廠)，電子天平(FA1004，上海良平儀器儀表有限公司，精度為萬分之一)，電子天平(CPA225D，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為十萬分之一)，顯微鏡(C1503270007，北京舜宇光學(xué)科技有限公司)，超聲波清洗器(SB-4200DTS，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)，中藥粉碎機(jī)(DFT-200，溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，水浴鍋(DZKW-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，薄層板(硅膠G，青島海洋化工廠)，高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國Agilent公司)

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 性狀鑒別

對搜集到的27批水柏枝藥材的性狀進(jìn)行研究。

結(jié)果表明，不同基原水柏枝藥材的性狀有所不同。具鱗水柏枝：枝黃褐色、紅褐色、灰褐色，光滑，有條紋，常被白色皮膜，易脫落。葉較小，披針形、卵狀披針形、長圓形或狹卵形，長1.5～3 mm，寬0.5～2 mm，先端鈍或銳尖。單個或數(shù)個花序簇生于枝腋，氣清香，味淡，微苦。小花水柏枝：葉較小，長1.5～3 mm，寬0.5～2 mm，花萼長不及花瓣之半。三春水柏枝：葉較小，長1.5～3 mm，寬0.5～1 mm，花萼稍短于花瓣。秀麗水柏枝：葉較大，常生于綠色小枝上，長2～10 mm，寬2～3 mm。

2.1.2 顯微鑒別

采用常規(guī)顯微鑒定方法，分別對木纖維、草酸鈣簇晶、下表皮細(xì)胞、氣孔、及螺紋導(dǎo)管觀察，并進(jìn)行顯微攝影。木纖維多成束，無色或淡黃色，直徑6～13 μm，壁厚。草酸鈣簇晶居多，直徑 6～18 μm，菱角較鈍。下表皮細(xì)胞表面觀多角形，外壁稍彎曲。氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～9個。導(dǎo)管以螺紋導(dǎo)管居多，直徑6～17 μm(見圖1)。

注：1-表皮細(xì)胞；2-導(dǎo)管；3-簇晶；4氣孔；5木纖維

2.1.3 薄層色譜定性鑒別

取水柏枝樣品粉末1 g，加甲醇20 mL，100%功率超聲(250 W，40 kHZ)處理60 min，放冷至室溫，濾過，作為供試品溶液。取水柏枝對照藥材(XL-1)1 g，同法制得對照藥材溶液(a)。最佳薄層色譜條件為：取對照藥材溶液(a)3 μL及供試品溶液3～6 μL，點于同一硅膠G薄層板上，甲苯-乙醚-丙酮(7∶2∶0.15)為展開系統(tǒng)展開，上行展距8 cm，105℃加熱至斑點清晰，365 nm紫外光燈檢視。供試品在與水柏枝對照藥材色譜(a)相應(yīng)的位置上，顯4個相同紅色的斑點(見圖2)。

2.2 檢查

按2020年版《中國藥典》(四部)[13]分別對27批水柏枝藥材水分、灰分及30%乙醇浸出物進(jìn)行測定。結(jié)果表明，27批水柏枝藥材的水分在7.18%～10.00%范圍內(nèi)，平均值為9.35%。總灰分在2.30%～10.70%范圍內(nèi)，平均值為7.23%。酸不溶性灰分在0.10%～1.46%范圍內(nèi)，平均值為0.77%。醇溶性浸出物含量在13.49～39.47%范圍內(nèi)，平均值為27.42%(見表2)。

注：a為對照藥材溶液；JL-1-SC-4為不同批次供試品溶液

2.3 HPLC法測定水柏枝中槲皮素的含量

2.3.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3(5 μm,4.6×250 mm)柱；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液(36∶64)；體積流量1 mL/min；檢測波長為370 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL；采樣時間為20 min。供試品和槲皮素對照品的HPLC色譜圖見圖3。

圖3 槲皮素對照品(A)和水柏枝供試品(B)HPLC色譜圖

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱定槲皮素(C15H10O7)對照品24.96 mg，加甲醇制成0.998 4 mg/mL的對照品儲備液。

2.3.3 供試品溶液的制備

精密稱定水柏枝樣品粉末(50目)約1 g，加乙醇10 mL、鹽酸3 mL，加熱回流提取30 min，冷卻至室溫，搖勻，濾過，續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得[14]。

表2 水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物和槲皮素含量測定結(jié)果 n=2，%

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.3.2”項下的對照品貯備液(0.998 4 mg/mL)0.5、1.25、2、2.5、5 mL至不同的10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，進(jìn)樣測定。以峰面積值(Y：mAU)和槲皮素濃度(X： mg/mL)進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y=36 326X+405.07(r=0.999 8)，槲皮素在0.05～0.5 mg/mL質(zhì)量濃度的范圍內(nèi)與峰面積顯示良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度實驗

精密稱取XL-1批水柏枝藥材粉末(50目)，按“2.3.3”項下方法制備，進(jìn)樣測定，測得槲皮素日內(nèi)、日間精密度峰面積的RSD值分別為0.56%、2.26%，儀器精密度較好。

表3 槲皮素加樣回收率試驗結(jié)果 n=6

2.3.6 穩(wěn)定性實驗

精密稱取XL-1批水柏枝藥材粉末(50目)，按“2.3.3”項下方法制備，在0、2、4、8、12 h后進(jìn)樣，進(jìn)樣測定，測得槲皮素含有量RSD值為2.62%，表明制備的供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性實驗

精密稱取XL-1批水柏枝藥材粉末(50目)6份，每份約1.0 g，按“2.3.3”項下方法制備，進(jìn)樣測定，得槲皮素含量RSD值為1.25%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收實驗

精密稱取槲皮素含有量已知的水柏枝藥材粉末(50目，XL-1)6份，每份約0.5 g，按1∶1比例加入適量槲皮素對照品(1.670 mg)，按“2.3.3”項下方法制備，進(jìn)樣測定，槲皮素平均回收率為99.09%(見表4)。

表4 槲皮素加樣回收率試驗結(jié)果 n=6

2.3.9 樣品含量測定

取27批水柏枝藥材粉末(50目)，各約1 g，每批平行兩次，按“2.3.4”項下方法制備，進(jìn)樣測定(見表2)。

3 結(jié)果與討論

3.1 薄層色譜鑒別方法考察

本實驗考察了甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶0.3)、甲苯-乙醚-甲酸(7∶4∶0.2)、甲苯-乙醚-丙酮(7∶2∶0.15)等展開體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲苯-乙醚-丙酮(7∶2∶0.15)展開效果較好，Rf值適宜，且斑點清晰。此外，比較了不同薄層板(硅膠G板、硅膠GF254板、自制手工硅膠G板)、點樣量(1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL)、點樣方式(圓點、條帶)、不同展開劑(10%硫酸乙醇溶液、1%三氯化鋁乙醇溶液)、不同溫度(4℃、20℃、30℃)和不同濕度(18%、32%、70%)對薄層展開結(jié)果的影響，最終確定了最佳的薄層鑒別方法。

3.2 HPLC色譜條件和供試品溶液制備方法考察

本實驗考察了不同的流動相體系(甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液)對供試品溶液的洗脫分離情況，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%磷酸水溶液更優(yōu)，并對其洗脫比例進(jìn)行了優(yōu)化。此外，比較了Inertsil ODS-3(5μm,4.6 mm×250 mm)、SPOLAR(5μm,4.6 mm×250 mm)、CAPCELL PAK(5μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱的分離情況，發(fā)現(xiàn)以Inertsil ODS-3(5μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱檢測時槲皮素色譜峰峰形、分離度良好；比較了不同柱溫(25℃、30℃、35℃)、不同檢測波長(254 nm、360 nm、370 nm)的影響，最終確定色譜條件。此外，在供試品溶液制備中，考察了提取方法、時間、提取溶劑種類、用量、鹽酸用量等條件，確定了最佳提取方法。

3.3 HPLC含量測定指標(biāo)的選擇

藏藥水柏枝主要活性成分為黃酮類成分，與其抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化的藥理活性具有一定的相關(guān)性[9,11]。然而，這些黃酮類成分大多以糖苷形式存在，缺乏法定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而其中最主要的苷元成分為槲皮素[15]。因此，本研究以酸水解后的苷元槲皮素為指標(biāo)，建立HPLC含量測定方法。

3.4 水柏枝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草方案

本研究收集的27批水柏枝藥材來自于四川、西藏、青海等藏區(qū)，具有代表性，可充分反映在市場流通中藏藥水柏枝的實際情況。根據(jù)測定結(jié)果，27批水柏枝藥材的水分在7.18%～10.00%范圍內(nèi)，因此建議規(guī)定其水分不得過11.00%；總灰分含量在2.30%～10.70%范圍內(nèi)，因此建議規(guī)定其總灰分不得過11.00%；酸不溶性灰分含量在0.10%～1.46%范圍內(nèi)，因此建議規(guī)定其酸不溶性灰分不得過1.50%；醇溶性浸出物含量在13.49%～39.47%范圍內(nèi)，因此建議規(guī)定其醇溶性浸出物不得少于13%。

根據(jù)HPLC含量測定可知，不同基原水柏枝藥材中槲皮素含量差異較大，范圍在0.02%～0.38%，主要產(chǎn)于西藏的秀麗水柏枝藥材的槲皮素含量最高，平均為0.28%；而具鱗水柏枝槲皮素含量最低，平均值為0.09%。小花水柏枝和三春水柏枝的槲皮素含量平均值分別為0.13%和0.12%。結(jié)合考慮水柏枝基原、產(chǎn)地等因素，暫定水柏枝藥材按干燥品計算其槲皮素含量應(yīng)不得少于0.02%。