宗毅，彭家艷，張琨，趙可惠，張傳濤，龍坤蘭，陳駿，周秀娟，高培陽▲，范剛

(1.成都中醫(yī)藥大學 藥學院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610075；3.成都中醫(yī)藥大學 民族醫(yī)藥學院，四川 成都 611137)

2019年12月起，一種具有極強傳染能力的新型冠狀病毒(Corona Virus Disease 2019，COVID-19，簡稱“新冠肺炎”)在全球范圍內(nèi)迅速傳播。2020-03-11世界衛(wèi)生組織正式宣布將新冠肺炎列為全球性大流行病(Pandemic)[1]。截至2022年3月，全球因患新冠肺炎累計死亡人數(shù)已達六百萬。最初冠狀病毒的細胞感染被認為是通過與質(zhì)膜直接融合進入細胞的，由病毒的表面突刺蛋白(Spike，S)介導發(fā)生，而后發(fā)現(xiàn)病毒的進入還可能涉及內(nèi)吞作用。S蛋白由兩個亞基組成：S1和S2，S1亞基允許病毒結(jié)合宿主細胞受體，而S2允許病毒和細胞膜融合[2]。在S蛋白與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2(ACE2)結(jié)合后，組織蛋白酶L(CTSL)切割S2位點，誘發(fā)膜融合[3]，經(jīng)細胞內(nèi)吞，病毒在SARS-CoV-2 3L水解酶(Mpro)的作用下進行RNA復制[4]，完成其分裂過程。

為充分發(fā)揮中醫(yī)藥在新冠肺炎預防、治療、康復中的作用，結(jié)合時令特點和當前疫情防控形勢，四川省中醫(yī)藥管理局組織專家對技術(shù)指南進行修訂，形成了《四川省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥防控技術(shù)指南(第六版)》。其中，成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內(nèi)處方“新冠2號”由銀花、連翹、厚樸等13味中藥組成，具有辛涼解表、芳香化濕的功效，主要應用于治療新冠肺炎引起的發(fā)熱、不惡寒、咽干咽痛、胸悶、脘腹痞滿等臨床表現(xiàn)。

本文采用分子對接方法探究“新冠2號”處方干預新冠肺炎的機制。分子對接技術(shù)是一種能快速準確地預測蛋白-配體復合物結(jié)合構(gòu)象和親和力并輔助篩選活性成分的重要研究技術(shù)[5]，主要根據(jù)分子靶板的大型化合物庫，采取基于結(jié)構(gòu)或基于配體的方法，在可承受的時間內(nèi)虛擬篩選數(shù)百萬種化合物，從而預測小分子配體與合適的靶結(jié)合位點的結(jié)合構(gòu)象[6]。這種先考慮先導化合物，進而設(shè)計藥物[7]的方法也為增加藥物的靈敏性、特殊性、預測性提供作用[8]。通過對“新冠2號”中的化合物與SARS-CoV-2 3L水解酶(Mpro)和組織蛋白酶L(CTSL，cathepsin L)兩種靶蛋白進行對接，篩選其核心藥物以及活性分子，以期進一步尋找抗新冠肺炎的中醫(yī)藥有效活性小分子，為中醫(yī)藥臨床應用發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP：http://tcmspw.com/tcmsp.php)；中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(ETCM：http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)；網(wǎng)絡藥理在線數(shù)據(jù)庫(TCMID：http://www.mega bionet.org/tcmid/)；PubChem網(wǎng)站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；RCSB PDB數(shù)庫(https://www.rcsb.org/)；Schr?dinger；Maestro11.9、ChemBioDraw Ultra 14.0。

1.2 方法

1.2.1 “新冠2號”化學成分收集與處理

本研究通過《四川省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥防控技術(shù)指南(第六版)》頒布的關(guān)于“新冠2號”全部中藥成分為關(guān)鍵詞在ETCM數(shù)據(jù)庫、TCMSP數(shù)據(jù)庫、TCMID數(shù)據(jù)庫中檢索，下載其(*.sdf)格式文件。此外以相關(guān)文獻為輔助并使用ChemBioDraw Ultra 14.0軟件畫出小分子的結(jié)構(gòu)，保存為(*.sdf)文件格式，進行整理歸納得到處方化學小分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 小分子配體和靶蛋白的獲取與處理

將整理好的化合物SDF文件導入計算機輔助藥物設(shè)計軟件Schr?dinger中，用默認的參數(shù)在LigPrep模塊中的OPLS_2005力場下進行優(yōu)化處理，獲得小分子配體。并從PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank,簡稱PDB)中以(*.pdb)格式下載Mpro(PBD ID:6LU7)和CTSL(PBD ID:5MQY)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。將兩個靶標蛋白依次導入，對蛋白補缺失的側(cè)鏈、調(diào)整鍵序、加氫、去水、去除無關(guān)溶劑等預處理步驟，并預測氨基酸的質(zhì)子化狀態(tài)(pH=7.0±2.0)，最后在OPLS_2005的力場下對蛋白質(zhì)進行能量最小化，以確保蛋白具有合理的空間取向。

1.2.3 小分子配體與靶蛋白的分子對接

根據(jù)RCSB PDB中數(shù)據(jù)參考，選取Mpro、CTSL兩種蛋白的已知自帶的抑制劑小分子為中心，生成配體分子與受體分子的網(wǎng)格，相關(guān)參數(shù)設(shè)為默認值。在Ligand Docking模塊導入處理好的靶蛋白以及“1.2.2”生成的小分子配體，在標準精度(SP)下進行柔性對接。并利用Glide gsore打分系統(tǒng)篩選最終結(jié)果。對于Glide Gscore SP一般認為其值≤-10時，小分子與蛋白的對接效果較好，其值≤-8時，小分子和蛋白質(zhì)可能有不錯的結(jié)合自由能。(https://www.schrodinger.com/kb/639)

2 結(jié)果與分析

2.1 “新冠2號”化學成分收集結(jié)果

由相關(guān)文獻了解到，于明坤等通過對各地新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)診療方案總結(jié)，新冠肺炎的認識病位在肺[9]，基本病機特點為“寒、濕、毒、疫”[10]?！靶鹿?號”制劑由銀花、連翹、荊芥等13味藥材組成，大多歸肺、脾經(jīng)，用于應對風熱夾濕癥，辛涼解表，芳香化濕，用于緩解發(fā)熱、口渴、咽干咽痛、胸悶等臨床表現(xiàn)癥狀。現(xiàn)針對處方中每味中藥所含化學小分子數(shù)目、性味歸經(jīng)以及其功效應用進行歸納總結(jié)見表1。

表1 “新冠2號”中藥化學成分數(shù)目、性味歸經(jīng)及其功效應用[11]

2.2 分子對接結(jié)果

“新冠2號”中的1 720個化學成分和2個新冠肺炎相關(guān)的靶蛋白進行分子對接，在SP精度下，共找到58個成分對接得分≤-8的小分子。以Mpro為對接蛋白，篩選得到對接得分≤-9的活性成分12個；以CTSL為對接蛋白，篩選得到對接得分≤-9的1個活性成分，對接得分≤-8有9個活性成分，對接模式見圖1，具體數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

圖1 Mpro和CTSL與連翹酯苷F、厚樸苷B和1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-d-葡萄糖的分子對接模式

表2 小分子配體與Mpro、CTSL各靶蛋白的對接結(jié)果

“新冠2號”對接效果較好的小分子中有9個成分能同時作用于2個靶蛋白，包括1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-d-葡萄糖、連翹酯苷A、連翹酯苷F、連翹酯苷G、厚樸苷B、madreselvin B、1,3-二-[2-(3,4-二羥基苯基)-1-羧基]乙酯基(乙氧羰基)-2-(3,4-二羥基苯基)-7,8-二-羥基-1,2-二氫萘、1-[2-(3,4-二羥基苯基)-1-甲酯基(甲氧羰基)]乙酯基(乙氧羰基)-2-(3,4-二羥基苯基)-3-[2-(3,4-二羥基苯基)-1-羧基]乙酯基(乙氧羰基)-7,8-二羥基-1,2-二氫萘和半木脂素A均能同時作用于Mpro和CTSL。在與CTSL對接效果較好的9個活性小分子中，僅連翹酯苷B未與Mpro達到較好對接效果。

2.3 小分子配體與靶蛋白的結(jié)合模式分析

2.3.1 Mpro與其活性成分的結(jié)合模式分析

Mpro對于病毒的復制至關(guān)重要，是一個優(yōu)秀的藥物靶點。香磺苷和大豆腦苷與Mpro對接評分<-10，結(jié)合能力較為優(yōu)異，二維對接結(jié)果如圖2所示。小分子配體與Mpro的結(jié)合方式主要以氫鍵為主。以香磺苷為例，根據(jù)文獻可知香磺苷作為金銀花中活性化合物，參與金銀花發(fā)揮抗菌、抗氧化、抗病毒等藥理作用[13]。與作為氫鍵受體的ASN 142、GLU 166、THR 190氨基酸殘基的羥基形成氫鍵，與氫鍵供體GLY 143氨基酸殘基醚鍵中的氧形成氫鍵，對接評分為-10.632。

圖2 Mpro(PBD ID:6LU7)與其活性成分的二維對接結(jié)果

2.3.2 CTSL與其活性成分的結(jié)合模式分析

組織蛋白酶L是一種肽酶，此前有報道稱，CTSL參與了埃博拉和SARSCoV的病毒糖蛋白加工，這一病毒過程是細胞膜融合和宿主細胞進入的關(guān)鍵過程，CTSL對溶酶體中S蛋白啟動病毒進入也非常重要[14]。從對接結(jié)果來看，madreselvin B、厚樸苷B、1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-d-葡萄糖、連翹酯苷A四個小分子對接評分較高，結(jié)合能力較為突出，二維對接結(jié)果如圖3所示。小分子配體與CTSL的結(jié)合方式也主要以氫鍵為主。據(jù)相關(guān)研究指出，連翹具有顯著的內(nèi)毒素中和、解熱以及清熱解毒功效，有抑制多科致病菌(包括金黃色葡萄球菌)的作用[15-16]。以連翹酯苷A為例，是連翹主要特征性有效成分的一種苷類化合物，與作為氫鍵受體的ASN 66、GLN 21、GLY 20、MET 161氨基酸殘基的羥基形成氫鍵，對接評分為-8.416。

圖3 CTSL(PBD ID:5MQY)與其活性成分的二維對接結(jié)果

3 討論

SARS-CoV-2進入靶細胞需要通過細胞蛋白酶啟動S蛋白，S蛋白在S2位點上裂解。根據(jù)病毒株和細胞類型的不同，冠狀病毒S蛋白可能被一個或多個宿主蛋白酶切割，其中就包括組織蛋白酶L。之后釋放病毒RNA，在3Cl水解酶(Mpro)的作用下病毒開始復制[17]。本研究以Mpro和CTSL為靶蛋白，從“新冠2號”中篩選出多個成分能與之結(jié)合，符合中醫(yī)藥“多成分-多靶點”學說，為尋找Mpro、CTSL抑制劑分子提供參考。

對接結(jié)果表明，“新冠2號”中有13個小分子與CTSL、Mpro對接的效果較好，如連翹酯苷A、連翹酯苷B、香磺苷、厚樸苷B、1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-d-葡萄糖等，可能為與新冠病毒靶蛋白對接的活性成分。從藥理作用角度分析，連翹作為一種廣譜抗菌藥，對多種革蘭氏陽性及陰性細菌有抑制作用，有抑制病毒直接侵入人體的作用，而連翹酯苷類對金黃色葡萄球菌等十一種致病菌均有極強的抑制作用[18]；金銀花中香磺苷與兩個靶蛋白均有潛在的結(jié)合能力，可能有抑制新冠病毒直接入侵人體細胞的作用；1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-d-葡萄糖屬于半夏多糖類，是一種天然的多酚化合物，其通過抑制許多細胞因子表現(xiàn)出抗炎作用[19]，并對脂多糖誘導的肺上皮細胞炎癥損傷有一定的保護作用[20]，與兩種靶蛋白結(jié)合均有較好的效果，有抑制冠狀病毒復制和病毒與機體細胞結(jié)合的潛在能力。

綜上所述，中藥的方劑由活性成分群構(gòu)成，活性成分群按照一定要求配伍組合，通過多靶點、多途徑整合發(fā)揮作用[21]，這也是中藥發(fā)揮效用的重要原因之一。利用中藥多成分、多靶點的機制，與現(xiàn)代分子對接技術(shù)相結(jié)合，可以為中醫(yī)藥治療新冠肺炎提供新的思路。本研究通過分子對接技術(shù)揭示了“新冠2號”治療新型冠狀病毒肺炎的潛在活性成分，研究結(jié)果可為“新冠2號”的臨床應用和開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也可為尋找Mpro、CTSL抑制劑提供一定的參考。然而，分子對接為計算機虛擬篩選技術(shù)，發(fā)現(xiàn)的潛在活性成分今后還要進行進一步的藥效驗證。例如，可以采用制備液相色譜法從藥材中分離得到這些潛在的活性成分，再結(jié)合嚙齒類COVID-19動物模型[22]進行活性驗證，從而確定藥效物質(zhì)。