◎ 何詠欣，陳嘉欣，龔海錕，楊嘉鑫威，張 輝，林澤珊，黃景初，錢振杰

（廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511400）

四環(huán)素類物質(zhì)（四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素和金霉素）是一類較為常見的獸藥，常用作廣譜抗病原微生物的快速抑菌劑，高濃度時能對某些細菌有殺菌效果。由于四環(huán)素類抗生素抑菌效果好、價格便宜，具有防治腸道感染和促進生長等優(yōu)點，在畜類、禽類、水產(chǎn)品飼料添加劑和藥品等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中廣泛使用[1]。但在生產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中無節(jié)制地使用四環(huán)素類藥物會導(dǎo)致其在動物食品及其制品中大量殘留，人們可通過食物攝入殘留藥物進而危害身體健康。因此，在食品安全監(jiān)管的重點監(jiān)測項目中包括動物源性食品中四環(huán)素類藥物的殘留量。

目前，水產(chǎn)品中四環(huán)素類獸藥殘留檢測主要采用高效液相色譜法[2-4]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-8]?！妒称钒踩珖覙藴?水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素殘留量的測定》（GB 31656.11—2021）增加了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，方法檢出限更低，靈敏度更高。研究不確定度來源是對測量結(jié)果準確度的重要評定標準之一，能在一定程度上反映該測定方法的準確性和可信度[9]。本文依據(jù)《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）[10-13]、《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL006：2019）[14]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[15]等標準，結(jié)合日常檢測發(fā)現(xiàn)蝦類樣品中四環(huán)素類藥物殘留相對較多。本文對GB 31656.11—2021中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中四環(huán)素殘留量的不確定度進行分析與評定，為確保檢測結(jié)果準確度、可信度和加強實驗室的質(zhì)量控制及規(guī)范養(yǎng)殖業(yè)用藥安全提供依據(jù)[16-20]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦類，購于廣州市場；鹽酸土霉素標準品（CAS No：2058-46-0）、四環(huán)素鹽酸鹽標準品（CAS No：64-75-5）、金霉素鹽酸鹽標準品（CAS No：64-72-2）和多西環(huán)素標準品（CAS No：24390-14-5），均為德國Dr.廠家提供；乙腈、甲醇、乙酸乙酯和正己烷（色譜純，美國Thermo 公司）；甲酸、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；檸檬酸、磷酸氫二鈉（分析純，廣東光華科技公司）；醋酸鉛（分析純，上海安譜公司）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，沃特世公司）；氮氣（99.999%，大成廣州氣體公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 4000 QTRAP 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配ESI離子源（美國AB 公司）；電子天平（精度0.01 g，德國賽多利斯公司）；電子天平（精度0.000 01 g，德國賽多利斯公司）；離心機（德國Sigma 公司）；渦旋振蕩器（德國IKA 公司）；超聲波清洗儀（上海安譜公司）；系列刻度吸管（A 級，天津天玻公司）；系列移液器（德國艾本德公司）；氮吹儀（美國Organomation 公司）；超純水機（法國Millipore 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

按照GB/T 30891—2014 附錄B 中的要求制樣，取均質(zhì)后的待測樣品為待測樣，取均質(zhì)后的空白樣品為空白樣，空白樣中添加20 μL 1.00 μg·mL-1標準工作液為加標樣。

按照GB 31656.11—2021 所述方法進行樣品前處理：稱取2.0 g（準確至±0.01 g）樣品使用提取液提取3 次，合并提取液后取部分提取液過固相萃取柱凈化，氮吹濃縮后及時測定。

1.3.2 混合標準工作液配制

稱取標準品鹽酸土環(huán)素10.51 mg、四環(huán)素鹽酸鹽10.29 mg、金霉素鹽酸鹽10.76 mg、多西環(huán)素10.07 mg，分別用甲醇定容于10 mL 棕色容量瓶，分別配制成濃度為1.0 mg·mL-1標準儲備液。分別吸取1 000 μL 標準儲備液定容至10 mL，配制成10.00 μg·mL-1的混合標準儲備液。吸取1.0 mL混合標準儲備液定容于10 mL容量瓶，配制成1.00 μg·mL-1標準工作液。

1.3.3 標準曲線制備

使用100 μL 或1 mL 量程的移液器分別準確吸取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL 和1.00 mL 1.00 μg·mL-1四環(huán)素類標準工作液于一系列10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度分別為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1的標準工作曲線溶液。每次實驗現(xiàn)用現(xiàn)配，以標準工作液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：3 μL；流動相：A 為甲醇，B 為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0.01～1.00 min，75%B，1.00～4.00 min，75%B～30%B，4.00～5.40 min，30%B，5.40～5.50 min，30%B～75%B，5.50～7.00 min，75%B。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：ESI 離子源。離子噴霧電壓為5 500 V；霧化氣：氮氣，40 psi；干燥氣：氮氣，流速10 L·min-1，溫度500 ℃；碰撞氣：氮氣；掃描模式：MRM 正離子掃描模式。

1.3.5 數(shù)學(xué)模型的建立

試樣中四環(huán)素類物質(zhì)殘留量的計算公式為

式中：X為試樣中四環(huán)素類物質(zhì)殘留量，μg·kg-1；C為樣品溶液中四環(huán)素類物質(zhì)的質(zhì)量濃度，ng·mL-1；V為提取液總體積，mL；m為試樣稱取的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度主要來源

通過分析實驗方法和數(shù)學(xué)模型，不確定度來源主要包括標準溶液的配制、前處理提取、樣品制備、儀器測定等步驟，參考文獻[21]將每個步驟細化繪制出不確定度來源圖，見圖1。

圖1 不確定度來源魚骨圖

2.2 標準溶液配制引入的不確定度

2.2.1 標準品純度引入的相對標準不確定度urel(S1)

經(jīng)標物證書查詢可得鹽酸土霉素、四環(huán)素鹽酸鹽、金霉素鹽酸鹽和多西環(huán)素4 種標準品的純度及其擴展不確定度，假設(shè)呈均勻分布根據(jù)文獻[14]可得標準物質(zhì)的相對標準不確定度的計算公式為由標準物質(zhì)純度引入的相對標準不確定度見表1。

表1 標準物質(zhì)純度引入的相對標準不確定度表

2.2.2 標準品稱量引入的相對標準不確定度urel(S2)

使用十萬分之一的電子天平稱取標準品，依據(jù)該天平附的檢定證書，其最大允許誤差為±0.05 mg，按均勻分布，包含因子則根據(jù)文獻[14]計算公式可計算出計算得到4種四環(huán)素類標準物質(zhì)稱量引入的相對標準不確定度，結(jié)果見表2。

表2 4 種四環(huán)素類標準物質(zhì)稱量引入的相對標準不確定度表

2.2.3 標準物質(zhì)溶液定容引入的相對標準不確定度urel(C1)

配制標準物質(zhì)溶液是用甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，依據(jù)《常用玻璃器具檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）可得，10 mL A 級容量瓶容量允差為±0.020 mL，按均勻分布，則根據(jù)文獻[14]公式可計算得出容量瓶體積校準引入的標準不確定度為

配制標準物質(zhì)溶液除了容量瓶標定引入的不確定度外，還有溫度引入的標準不確定度，實驗室的溫度變化范圍是（20±5）℃，溫度影響引入的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)計算，液體的體積膨脹遠大于容量瓶的體積膨脹，因此只考慮溶劑的體積系數(shù)，甲醇的膨脹系數(shù)為1.19×10-3℃-1，產(chǎn)生的體積變化為±（10×5×1.19×10-3）=0.059 5 mL，按均勻分布，則根據(jù)文獻[14]計算公式可得溫度引入的標準不確定度為

根據(jù)文獻[14]計算公式可得標準物質(zhì)溶液定容引入的不確定度為

根據(jù)文獻[14]計算公式可得標準物質(zhì)溶液定容引入的相對標準不確定度為

2.2.4 標準中間液及標準曲線配制過程中引入的相對標準不確定度urel(C2)

配制成1.00 μg·mL-1中間液：使用100 μL 移液器分別依次吸取99.9 μL、98.7 μL、94.4 μL 和95.4 μL 的多西環(huán)素、四環(huán)素鹽酸鹽、金霉素鹽酸鹽、鹽酸土霉素標準物質(zhì)溶液定容至10 mL 配制成濃度為10.00 μg·mL-1四環(huán)素類混標溶液，再使用1 mL 移液器吸取1 mL 混標溶液配制成1.00 μg·mL-1混標中間液。

標準曲線工作溶液按1.3.3 步驟配制。根據(jù)證書查詢并計算可得溶劑為甲醇時移液槍和容量瓶產(chǎn)生的不確定度，結(jié)果見表3。

表3 溶劑為甲醇時移液槍和容量瓶產(chǎn)生的不確定度表

則可計算得出配制標準中間液和標準工作液過程中引入的相對標準不確定度為

2.3 稱量樣品引入的相對標準不確定度urel(m)

實驗稱取2 g（準確至±0.02 g）樣品，由電子天平檢定證書可得，當稱樣范圍在0～50 g 時，其最大允許誤差為±0.01 g，采用B 類方法評定，按均勻分布，則稱量樣品引入的相對標準不確定度urel(m)為0.002 89。

2.4 樣品處理引入的相對標準不確定度urel(V總)

實驗過程中影響定量的步驟有3 部分。①樣品提取3 次，分3 次加入6 mL Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液和1 次2.0 mL 醋酸鉛溶液提取，使用10 mL 分度吸量管3次，使用2 mL分度吸量管1次。②精確取10.0 mL提取液上樣固相萃取柱，使用10 mL 分度吸量管1 次。③用1.0 mL 的0.1%甲酸水溶液溶解殘留物，使用1 mL 移液槍1 次。產(chǎn)生不確定度的主要來源是吸取提取液的10 mL 刻度吸管、2 mL 刻度吸管和1 mL 移液槍。根據(jù)檢定證書可得10 mL 刻度吸管的允許誤差為±0.05 mL，2 mL 刻度吸管的允許誤差為±0.012 mL，采用B 類方法評定，按均勻分布，根據(jù)文獻[14]計算公式可得10 mL 分度吸量管引入的相對標準不確定度urel(V10mL)為0.004 81，2 mL 分度吸量管引入的相對標準不確定度urel(V2mL)為0.003 46。根據(jù)表3可得1 mL 移液槍引入的相對標準不確定度urel(V1mL)為0.005 77。實驗用的提取液均用純水配制，緩沖鹽等物質(zhì)占比較小，所以提取液的膨脹系數(shù)均以水的膨脹系數(shù)計算。水的膨脹系數(shù)為2.08×10-4℃-1，實驗室的溫度變化范圍是（20±5）℃，按均勻分布，則由溫度引入的相對標準不確定度為

由此可得實驗過程中樣品前處理經(jīng)過稀釋濃縮富集后引入的相對標準不確定度為

2.5 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(curve)

將標準曲線的5 個濃度點的工作液上液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器檢測，每個濃度點重復(fù)測定3 次，橫坐標為標準溶液的濃度，縱坐標為標準曲線液質(zhì)圖譜峰面積，最小二乘法擬合得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，標準曲線及加標樣測定結(jié)果見表4和表5，標準曲線線性方程及其擬合引入的相對不確定度表見表6。

表4 標準曲線測定峰面積表

表5 加標樣測定結(jié)果表（n=6)

表6 標準曲線線性方程及其擬合引入的相對不確定度表

線性回歸方程的標準差Sy的計算公式為

標準曲線的擬合引入的標準不確定度計算公式為

標準曲線的擬合引入相對不確定度計算公式為

式中：Sy為標準曲線的標準差；n為標準曲線校準點的測量次數(shù)；a為校準曲線的斜率；b為校準曲線的截距；Ai為第i次測量時標準溶液的峰面積；ci為第i次測量時標準溶液的濃度，ng·mL-1；p為樣品溶液測量次數(shù)；c0為代入標準曲線線性方程所得的樣品溶液濃度的平均值，ng·mL-1；c曲線為標準溶液濃度點的平均濃度，ng·mL-1。

2.6 樣品重復(fù)性測定引入的相對標準不確定度urel(X)

取空白樣品加標，加標含量為20 μg·kg-1，經(jīng)提取處理后上機，用該曲線對加標樣重復(fù)測定6 次，通過公式計算得到樣品重復(fù)性測定引入的相對標準不確定度，結(jié)果見表7。

標準偏差Sx的計算公式為

樣品重復(fù)性測定及回收率的標準不確定度的計算公式為

計算樣品重復(fù)測定及回收率的相對標準不確定度為

式中：Sx為樣品重復(fù)性測定的標準偏差；n為測量次數(shù)；Xi為樣品的測定值，μg·kg-1；為測定樣品的平均值，μg·kg-1。

2.7 合成標準不確定度urel(W)

根據(jù)上述分析的不確定度計算合成標準不確定度urel(W)，結(jié)果見表7。計算公式為

表7 加標樣對應(yīng)含量及其相關(guān)不確定度表

2.8 擴展不確定度

根據(jù)表7中測得樣品中4 種化合物的平均含量，合成標準不確定度的計算公式為u=urel(W)×，可得u(CTC)=0.053 9×18.6=1.002 54 μg·kg-1；u(DC)=0.049 3×18.8=0.926 84 μg·kg-1；u(OTC)=0.048 6×19.3=0.937 98 μg·kg-1；u(TC)=0.049×19.2=0.940 8 μg·kg-1。

根據(jù)《化學(xué)分析中測量不確定度評估指南》對檢驗實驗室的規(guī)定[14]，在置信區(qū)間P=95%時，擴展因子取k=2，擴展不確定度計算公式為U=k×u。因此，U(CTC)=2×1.002 54=2.005 08 μg·kg-1；U(DC)=2×0.926 84=1.853 68 μg·kg-1；U(OTC)=2×0.937 98=1.875 96 μg·kg-1；U(TC)=2×0.940 8=1.881 6 μg·kg-1。最終測得金霉素含量為（18.6±2.0）μg·kg-1（k=2）；多西環(huán)素含量為（18.8±1.9）μg·kg-1（k=2）；土霉素含量為（19.3±1.9）μg·kg-1（k=2）；四環(huán)素含量為（19.2±1.9）μg·kg-1（k=2）。根據(jù)不確定度分析計算結(jié)果繪制四環(huán)素類化合物不確定度分量占比圖，見圖2。

圖2 測定四環(huán)素類4 種化合物的不確定度分量柱狀圖

3 結(jié)論

本研究依據(jù)《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素殘留量的測定》（GB 31656.11—2021）測定蝦中四環(huán)素類藥物的殘留量，對實驗中產(chǎn)生的各種不確定度進行計算與評定。結(jié)果表明，標準曲線配制引入的不確定度最高，其次是標準曲線擬合引入的不確定度，而其他因素引入的不確定度相對較小。因此，通過選擇適合量程的高等級移液器與容量瓶、選擇合適的濃度點、減少標準溶液稀釋次數(shù)和標曲擬合中選擇合適的權(quán)重方式，可提高檢測結(jié)果的準確度。同時，采取增加樣品測定次數(shù)、加標回收、儀器比對、人員比對等質(zhì)控方式降低實驗誤差，也是減小試驗不確定度的有效途徑。