李 雪范俊芬王雨晴羅玉敏趙海蘋*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院,腦血管病研究室,北京 100053;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,腦病一科, 北京 100078)

中性粒細胞是細胞免疫系統(tǒng)的主要組成部分,以抵御病原體入侵。 在炎癥或損傷發(fā)生時,中性粒細胞從血液中被募集,從血管內(nèi)游出并趨化到病灶,吞噬殺傷病原微生物或變異細胞,中性粒細胞發(fā)揮定向遷移、吞噬、產(chǎn)生活性氧等功能,這一系列過程需要精細調(diào)控,中性粒細胞膜離子通道在其中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。 中性粒細胞膜離子通道包括電壓門控質(zhì)子通道(voltage-gated proton channel/votage-sensing domain only protein, Hv1/VSOP)、鉀通道、ATP 門控P2X1通道以及氯通道。

1 中性粒細胞的生理功能

中性粒細胞來自于骨髓造血系統(tǒng),在炎癥發(fā)生時,成熟的中性粒細胞從骨髓釋放到血液,再從血液中被招募到感染或者炎癥的部位。 病原體或炎癥病灶導(dǎo)致組織巨噬細胞和肥大細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)或白介素等細胞因子,誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞活化和細胞表面粘附因子的表達,從血液中招募中性粒細胞。 這一級聯(lián)反應(yīng)包括招募、滾動、粘附、血管內(nèi)遷移、游出,許多綜述詳細地闡述了這一過程[1-2]。

遷移能力是中性粒細胞的重要特征之一。 遷移在血管內(nèi)爬行時起作用,使中性粒細胞越過內(nèi)皮到達適當(dāng)?shù)奈恢?比如遷移到炎癥部位,對抗病原體。 最近的證據(jù)表明,反向遷移有助于消除炎癥,即中性粒細胞從嚴(yán)重病灶處遷移走[3-4]。 內(nèi)皮細胞中的選擇素和細胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)以及粒細胞中的P-選擇素糖蛋白配體1(p-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL1)和β 整合素是這些過程的重要粘附受體。中性粒細胞被內(nèi)皮表面的趨化物激活,觸發(fā)整合素的構(gòu)象變化,從而加強中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的粘附,這對于隨后的中性粒細胞游出非常重要[5]。 αβ整合素的缺失,會導(dǎo)致明顯的遷移延遲[6]。 另一方面,正確的遷移需要羅盤機制和引擎機制雙重調(diào)控,才能使中性粒細胞準(zhǔn)確遷移至病灶部位。

中性粒細胞,類似于巨噬細胞和樹突狀細胞,是專門的吞噬細胞,以受體介導(dǎo)的方式將病原顆?；蚣毎槠瑵撛谕淌刹?nèi)化。 作為血液中最多的吞噬細胞,中性粒細胞在防止病原體傳播方面發(fā)揮著不可或缺的作用。 中性粒細胞的殺菌作用,也與細胞膜電位的平衡有關(guān)。 中性粒細胞吞噬并夾帶這些顆粒進入吞噬體。 在“吞噬體成熟”過程中,它們與提供酶和酸性(在巨噬細胞中)或初始堿性(在中性粒細胞中)環(huán)境的其他囊泡融合,用以進行顆粒消化[7-8]。

中性粒細胞主要在其吞噬體內(nèi)產(chǎn)生活性氧,在NADPH 氧化酶2(NADPH oxidase 2, NOX2)驅(qū)動的“氧爆發(fā)”過程中,活化的中性粒細胞氧耗增加。NOX2 由膜結(jié)合成分和胞質(zhì)成分組成。 Gp91phox和p22phox(NADPH 氧化酶亞基)主要(85%)存在于特定顆粒的膜中。 剩下的15%在分泌囊泡和質(zhì)膜中表達[9]。 膜結(jié)合的NOX2 復(fù)合物介導(dǎo)NADPH 的電子釋放,并將其轉(zhuǎn)運到吞噬體外或細胞外。 NOX2有生電作用,并且其活性受膜電位的調(diào)節(jié),因此需要電荷平衡[7,10],即需要平衡細胞膜內(nèi)外的電荷,以保證NOX2 保持其活性。 源于NADPH 氧化的電子將分子氧還原為超氧化物(O2-),通過超氧化物歧化酶(superoxide dismutases, SOD)轉(zhuǎn)化為H2O2,隨后髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)介導(dǎo)過氧化氫(H2O2)和氯分子(Cl2)的反應(yīng),形成具有強氧化性的分子次氯酸(HOCl)分子,產(chǎn)生強殺菌作用。

本文主要關(guān)注的中性粒細胞膜離子通道包括電壓門控質(zhì)子通道(Hv1/VSOP)、鉀通道、ATP 門控P2X1通道以及氯通道。 下面將分別介紹這些離子通道及其功能。

2 電壓門控質(zhì)子通道(voltage-gated proton channel/votage-sensing domain only protein,Hv1/VSOP)

電壓門控質(zhì)子通道是調(diào)節(jié)中性粒細胞和其他免疫細胞免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子之一,其主要功能是在細胞呼吸爆發(fā)時維持細胞內(nèi)外pH 平衡和電荷補償,并參與活性氧的產(chǎn)生。

Hv1 由氫離子電壓門控通道蛋白1(hydrogen voltage gated channel protein 1, HVCN1)基因編碼,是介導(dǎo)質(zhì)子(H+) 在細胞膜上快速運動的膜蛋白[10-11]。 當(dāng)中性粒細胞發(fā)揮吞噬作用時,細胞內(nèi)pH 值(pHi)急劇下降,隨后迅速恢復(fù)。 這種酸化反應(yīng)是由于NADPH 氧化酶產(chǎn)生的H+引起的[12],Zn2+作為Hv1 的抑制劑,在Zn2+存在或HVCN1 缺陷的細胞中細胞液酸化會更快[12],與野生型小鼠的中性粒細胞相比,Hv1-/-中性粒細胞的胞漿酸性更強[13]。 與之相反則細胞液酸化很快被調(diào)節(jié),是Hv1的作用使pHi迅速恢復(fù)。 由此可知,Hv1 執(zhí)行維持中性粒細胞pH 平衡這個重要任務(wù)。

另外觀察到Hv1 缺乏的小鼠中性粒細胞去極化程度更高[13],這說明質(zhì)子通道的另一個重要作用是為去極化電子流提供補償電荷[14],這對呼吸爆發(fā)期間維持NADPH 氧化酶的活性至關(guān)重要。 中性粒細胞NADPH 氧化酶產(chǎn)生的電子電流,使膜去極化,如果沒有補償機制,跨膜電子傳輸強度高到足以產(chǎn)生無法承受的膜去極化和細胞內(nèi)酸化,最終會阻斷氧化酶本身的活性。 中性粒細胞NADPH 氧化酶產(chǎn)生的去極化必須通過離子轉(zhuǎn)運來抵消,恰好Hv1 發(fā)揮了電荷補償?shù)墓δ堋?所以,質(zhì)子流的主要功能是維持細胞呼吸爆發(fā)時的pH 平衡和電荷補償[15]。此外,在中性粒細胞的離子通道中同樣發(fā)揮電荷補償作用的還有氯通道。

此外,許多研究都支持這樣一個概念——HVCN1 是活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生所必需的最佳選擇[16]。 VSOP/Hv1 支持中性粒細胞吞噬活動中ROS 的產(chǎn)生[17],在HVCN1-/-斑馬魚模型中觀察到,HVCN1 缺乏顯著降低了中性粒細胞的ROS 生成[18]。 在體外培養(yǎng)的HVCN1 缺陷的斑馬魚幼體中性粒細胞中,NADPH 氧化依賴性細菌殺傷顯著降低[19],Hv1-/-小鼠中性粒細胞產(chǎn)生的超氧物和過氧化氫減少[13]。 除上文提到的Zn2+作為Hv1 的抑制劑外,鈷離子(Co2+)對Hv1 似乎也有抑制作用。 研究表明,在最大濃度為100 μmol/L Co2+時,Co2+可使人中性粒細胞殺傷兩株表皮葡萄球菌的能力降低7 倍[20]。 有趣的是Hv1 存在一種新的未預(yù)料到的活性,有研究部分提示Hv1 抑制嗜天青顆粒酶(包括MPO)的胞吐,導(dǎo)致的殺傷微生物的次氯酸HOCl 生成減少[21],這形成一個有趣的悖論,即Hv1 維持中性粒細胞NOX2 活性且促進活性氧(eactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生,但抑制次氯酸HOCl 的形成,其詳細機制仍待進一步研究。

3 K+通道

中性粒細胞表面的鉀離子通道包括鈣激活K通道、內(nèi)向整流鉀通道和ATP 敏感性鉀通道,在中性粒細胞不同的病理生理過程中分別發(fā)揮作用。

3.1 鈣激活鉀電流(calcium-activated potassium channel,KCa3.1)

鈣激活鉀電流KCa3.1通道是鈣激活鉀通道家族的一員。 電生理記錄表明,在人類中性粒細胞中存在鈣激活性鉀電流[22],Henriquez 等[23]首次證明KCa3.1在哺乳動物中性粒細胞中表達。 KCa3.1參與中性粒細胞的容積調(diào)節(jié),當(dāng)KCa3.1被阻斷時,離子霉素誘導(dǎo)的中性粒細胞更易腫脹。 KCa3.1還影響中性粒細胞的趨化性,KCa3.1抑制劑TRAM-34 培養(yǎng)中性粒細胞時,顯著降低白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)和fMLP 誘導(dǎo)的趨化反應(yīng),并且中性粒細胞KCa3.1的活性是細胞遷移“引擎機制”的重要組成部分,但是抑制KCa3.1不影響細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)或呼吸爆發(fā)[23]。 這提示KCa3.1對中性粒細胞趨化遷移有作用,但對其殺傷功能的作用還有待發(fā)掘。

3.2 內(nèi)向整流鉀電流K2.1

通過RT-PCR 研究顯示,小鼠骨髓和肝的靜息中性粒細胞表達內(nèi)向整流鉀電流Kir2亞基Kir2.1的mRNA,但不表達其他亞基(Kir2.2、Kir2.3和Kir2.4)的mRNA,并呈現(xiàn)具有同型Kir2.1通道電流特征的電流。 在缺乏對中性粒細胞增殖重要的生長因子[粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)和干細胞因子(stem cell factor,SCF)]的情況下,骨髓中性粒細胞短期培養(yǎng)的電流密度降低。 該研究表明小鼠中性粒細胞表達功能性Kir2.1通道,并提示這些通道可能對中性粒細胞的功能很重要,可能以生長因子依賴的方式發(fā)揮作用[24]。 但是,該內(nèi)向整流鉀電流是否在人類中性粒細胞中表達,至今尚未有文獻報道。

3.3 ATP 敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)

ATP 敏感性鉀通道是一類耦聯(lián)細胞代謝和電活動、以細胞內(nèi)的ATP/ADP 水平為門控因素、非電壓依賴性的特殊鉀離子通道,與中性粒細胞的趨化性相關(guān)。 硫化氫(H2S)通過K-ATP 通道依賴機制抑制G 蛋白耦聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)的表達來阻止CXC 趨化因子受體(CXC chemokine receptor 2,CXCR2)的內(nèi)化,增強中性粒細胞趨化反應(yīng),因此,體外實驗與對照組相比,骨髓中性粒細胞與NaHS(硫氫化鈉,300 μmol/L,NaHS 試劑能夠在體外以濃度依賴的方式釋放硫化氫)在37℃孵育1 h 后,巨噬細胞炎性蛋白- 2 (neutralization of macrophage inflammatory protein 2, MIP-2)誘導(dǎo)的中性粒細胞趨化性顯著增加;體內(nèi)實驗顯示H2S 通過激活K-ATP 通道抑制嚴(yán)重膿毒癥誘導(dǎo)的細胞間黏附分子(ICAM-1)下調(diào),這提示H2S 有利于中性粒細胞募集到感染病灶,防止中性粒細胞遷移失敗,減少細菌擴散,防止低血壓,并將小鼠存活率從大約12%提高到約80%[25]。

臨床上,有一個常用的ATP 敏感鉀通道抑制劑——格列本脲,格列本脲可抑制中性粒細胞的遷移和趨化,并在急性炎癥反應(yīng)期間影響血漿滲出,其影響可能與其ATP 敏感鉀(K-ATP)通道活性被阻斷有關(guān)[26]。 Pompermayer 等[27]的實驗驗證了這一猜想,格列本脲顯著抑制了再灌注誘導(dǎo)的中性粒細胞聚集與升高的腎血管通透性,對大鼠腎缺血再灌注損傷有保護作用。 此外,格列本脲可減輕順鉑所致腎損害[28-29],但具體機制是否與阻斷ATP 敏感鉀通道有關(guān),仍需進一步研究。

4 ATP 門控離子通道P2X1

P2X1受體(P2RX1)表達于參與血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)和/或免疫的多種細胞類型上,即動脈平滑肌細胞(SMCs)、中性粒細胞、巨噬細胞和血小板[30]。P2RX1在中性粒細胞上的功能,主要可以降低中性粒細胞活化和遷移。 人中性粒細胞表達功能性P2X1離子通道,全細胞膜片鉗顯示,兩種P2X1激動劑——β,γ-methylene ATP(β,γ-MeATP)和α,β-MeATP(α,β-methylene ATP)可誘發(fā)快速脫敏內(nèi)向電流,這些電流通過激活RhoA-ROCK 通路促進中性粒細胞趨化性;反之,在P2X1-/-小鼠腹膜分離的中性粒細胞中靜態(tài)粘附受損,速度降低,后緣回縮時間延長[31]。 另外發(fā)現(xiàn)P2X1-/-中性粒細胞產(chǎn)生更多的活性氧。 LPS 處理的P2X1-/-小鼠血液中髓過氧化物酶的釋放量增加,循環(huán)中性粒細胞和單核細胞表達更高水平的整合素αM(CD11b),小鼠對感染性休克的易感性增加,說明P2X1離子通道的抑制或缺失導(dǎo)致中性粒細胞過度活化和氧化反應(yīng),也就是說P2X1離子通道通過負性調(diào)節(jié)全身中性粒細胞活化和趨化性,從而限制氧化反應(yīng)和器官損傷,在內(nèi)毒素血癥中起保護作用[32]。

5 氯通道

氯通道在中性粒細胞中的主要作用是平衡細胞呼吸爆發(fā)所致的膜過度去極化,即電荷補償。 中性粒細胞NADPH 氧化酶產(chǎn)生的電子電流(Ie)是生電性的[33],它能迅速地使膜電位去極化。 為了保證NADPH 氧化酶功能的持續(xù),Ie必須保持平衡以保持電中性,否則過分的去極化將阻止電子離開細胞,中性粒細胞將失去功能。 中性粒細胞NADPH 氧化酶產(chǎn)生的去極化必須通過離子轉(zhuǎn)運來抵消[34]。 在中性粒細胞中,膨脹激活的氯離子通道和電壓門控質(zhì)子通道都可以抵消吞噬細胞NADPH 氧化酶誘導(dǎo)的去極化[35]。 中性粒細胞與其他細胞不同,靜息細胞內(nèi)的Cl-濃度很高[36],在中性粒細胞中氯離子通道抑制劑抑制呼吸爆發(fā)已有報道[37],正常中性粒細胞氧化功能需要陰離子通道ClC-3[37]。 活化的中性粒細胞體積膨脹[38],在中性粒細胞中觀察到腫脹活化氯電流( swelling-activated chloride currents,IClswell),膨脹激活的氯離子通道可以抵消NADPH氧化酶所致的膜的去極化[34-35]。 Ahluwalia[35]首次在中性粒細胞中證明,在質(zhì)膜水平上,暴露于生理相關(guān)的細胞內(nèi)和細胞外氯離子濃度下,膨脹激活的氯離子通道激活可以抵消吞噬細胞NADPH 氧化酶所致的細胞膜去極化。 由此推測IClswell和電壓門控氯通道家族蛋白成員3 (voltage-gated chloride channel family protein 3, ClC-3)在活化的中性粒細胞中可能具有相似的特性。

此前,ClC-3 被認為是IClswell的候選分子[39]。那么,中性粒細胞中ClC-3 產(chǎn)生的電流是否與IClswell相同呢? 值得注意的是,ClC-3 產(chǎn)生的電流具有許多特性,與在IClswell中觀察到的電流相似[39],如果IClswell通道以雜多聚體的形式存在,則可能與ClC-3形成復(fù)合物,它們一起可能抵消NADPH 氧化酶產(chǎn)生的去極化[34]。 至于中性粒細胞中ClC-3 產(chǎn)生的電流是否與IClswell相同仍需要進一步的實驗來解決爭議。

在膜片鉗實驗中,人和小鼠中性粒細胞在傳統(tǒng)的全細胞模式下透析,觀察到一個氯離子電流在細胞透析后被激活,這種電流主要由細胞質(zhì)離子強度調(diào)節(jié)。 這種電流類似于經(jīng)典的、普遍存在的體積敏感型外向整流電流的特點:強烈的外向整流、艾森曼Eisenman1 型的選擇性序列、對外界pH 值不敏感以及三苯氧胺、DCPIB(一種體積敏感陰離子通道阻滯劑和IClswell阻滯劑)和WW781 的強烈抑制。 Behe等[40]發(fā)現(xiàn)這種電流基本上是由富含亮氨酸的8A 重復(fù)序列(leucine-rich repeat-containing 8A,LRRC8A)支持的。 在LRRC8A 外顯子3 中具有移碼突變的ebo/ebo 小鼠,其自然發(fā)生的LRRC8A 截短突變,突變不影響蛋白表達,但會顯著降低VRAC(volume regulated anion channel,體積調(diào)控性陰離子通道)活性,這種突變大大降低了中性粒細胞的Cl-電導(dǎo)。這些ebo/ebo 中性粒細胞是有吞噬能力的細胞,pH值的升高保持不變,其吞噬和呼吸爆發(fā)能力保持不變,空泡大小正常,與野生型的同類細胞沒有區(qū)別,這表明中性粒細胞基于LRRC8A 的Cl-電導(dǎo)對空泡的吞噬和內(nèi)穩(wěn)態(tài)不是必需的。 因此,中性粒細胞的LRRC8A 依賴性電導(dǎo)在很大程度上解釋了其“膨脹激活”Cl-電流,但并不是吞噬體殺傷室的穩(wěn)態(tài)所必需[40]。 另外,最近發(fā)現(xiàn)的LRRC8A 蛋白介導(dǎo)的氯電流[41]參與調(diào)節(jié)使細胞體積減小,可部分影響人類中性粒細胞的遷移[42],可見氯電流在細胞遷移方面也存在潛在作用。

6 總結(jié)與展望

本文概述了中性粒細胞中離子通道功能的當(dāng)前研究結(jié)果,包括Hv1 通道、鉀通道、ATP 門控的P2X1通道和氯通道幾個部分,涉及中性粒細胞pH平衡、電荷補償、趨化性、粘附性、侵襲力、ROS 產(chǎn)生等功能。 將各離子通道按其相關(guān)的中性粒細胞功能分類大致如下:(1)pH 平衡:Hv1/VOSP;(2)電荷補償:Hv1/VOSP、膨脹激活氯通道、LRRC8A 依賴性氯電流;(3)促活性氧產(chǎn)生:Hv1/VOSP;(4)負性調(diào)節(jié)活性氧產(chǎn)生:ATP 門控P2X1通道;(5)趨化性:KCa3.1(引擎機制),K-ATP;(6)負性調(diào)節(jié)趨化性:ATP 門控P2X1通道。 如Hv1/VSOP 促進活性氧產(chǎn)生提高殺傷作用、P2X1對內(nèi)毒素血癥的保護作用,可見中性粒細胞離子通道的功能對某些疾病的發(fā)生發(fā)展和治療有預(yù)測和指導(dǎo)作用,離子通道阻斷或增強可作為一種潛在的治療選擇。 然而,我們對已知的中性粒細胞離子通道的電生理特性的了解仍然相當(dāng)初級,離子通道在中性粒細胞功能中的作用還未被完全理解,對其他通道是否在中性粒細胞中表達及其功能還有待進一步研究。