王笑冉鄭 攀

(河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046)

發(fā)作性睡病一詞,由Gelineau 于1880 年首次提出,本病是一種原因不明的中樞性睡眠障礙,以白天不可抗拒的短期嗜睡發(fā)作和異常的快速動(dòng)眼睡眠(猝倒、睡眠幻覺(jué)和睡眠癱瘓)為典型特征,多于兒童或青年期起病[1]。 由于對(duì)此病缺乏認(rèn)識(shí),常出現(xiàn)漏診而延誤治療,嚴(yán)重影響患者的工作學(xué)習(xí)生活,甚至造成意外事故危及生命。 選擇合適的動(dòng)物模型用于研究該病發(fā)病機(jī)制,發(fā)掘潛在的治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。 本文對(duì)目前已有的發(fā)作性睡病模型進(jìn)行綜述,總結(jié)其誘發(fā)機(jī)制、模型應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)等,以便研究者可以據(jù)此選擇更貼合實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡脑炷７椒?獲得更準(zhǔn)確的研究結(jié)果。

1 自發(fā)性動(dòng)物模型

自發(fā)性動(dòng)物模型指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)任何人工干預(yù),在自然狀態(tài)下發(fā)生的、或由基因突變的異常表現(xiàn)通過(guò)遺傳育種保留下來(lái)的動(dòng)物疾病模型[2]。 目前,已證實(shí)的NRL 自發(fā)性模型為犬類動(dòng)物模型。 早在上世紀(jì)八十年代,人們?cè)谌砩习l(fā)現(xiàn)與人類發(fā)作性睡病極為相似的癥狀[3-4]。 1999 年,Lin 等[5]揭示了犬發(fā)作性睡病是由于食欲素受體2(orexin receptor 2, OX2R)的基因突變。 家族性發(fā)作性睡病呈常染色體隱性遺傳存在于杜賓犬和拉布拉多獵犬的品系中,由OX2R 基因的外顯子跳躍突變引起,而散發(fā)性犬發(fā)作性睡病與腦脊液中食欲素多肽顯著降低有關(guān)。 其表現(xiàn)為突然的肌張力喪失和快速動(dòng)眼睡眠(rapid eye movement sleep, REM)發(fā)作,首次出現(xiàn)在青春期前,成年后癥狀相對(duì)減輕[6-7]。 自此各種基于下丘腦泌素/食欲素系統(tǒng)(hypocretin,Hcrt)的動(dòng)物模型根據(jù)不同的研究目的被建立。

2 基因工程模型

2.1 基因敲除模型

2.1.1 Hcrt/Orexin 基因敲除小鼠

食欲素(orexin),又稱下丘腦泌素,是下丘腦外側(cè)區(qū)食欲素能神經(jīng)元合成和分泌的小分子神經(jīng)多肽(Hcrt-1、Hcrt-2 或稱Orexin-A、Orexin-B),其來(lái)源于同一種前體多肽并通過(guò)蛋白水解產(chǎn)生[8-9]。 人類食欲素原基因(prepro-orexin)由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子組成,通過(guò)克隆prepro-orexin-nlacZ融合基因替換小鼠prepro-orexin基因的第一個(gè)外顯子獲得重組基因并導(dǎo)入C57BL/6J 小鼠胚胎干細(xì)胞,借助雜交建立純合子Orexin 基因敲除小鼠。 經(jīng)免疫組化、原位雜交及放射免疫分析方法均證實(shí),該小鼠Hcrt神經(jīng)陽(yáng)性表達(dá)喪失,出現(xiàn)與人類NRL 相似的嗜睡、睡眠周期縮短及次數(shù)增加等癥狀。 表現(xiàn)為REM 潛伏期縮短,覺(jué)醒時(shí)間略有減少,覺(jué)醒-REM 轉(zhuǎn)換加快,但有正常的非快速動(dòng)眼睡眠(non-rapid eye movements, NREM )[10-11]。 Mochizuki 等[12]對(duì)Orexin 基因敲除小鼠進(jìn)行深入研究,證實(shí)其具有正常睡眠-覺(jué)醒行為的晝夜節(jié)律控制,且受Orexin 高度刺激的促覺(jué)醒單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如去甲腎上腺素和組胺等未見(jiàn)異常。 Orexin 基因敲除小鼠證明了Hcrt 神經(jīng)元是內(nèi)源性睡眠/覺(jué)醒調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要組成部分,但代償表達(dá)增強(qiáng)的下丘腦外側(cè)黑色素濃縮激素神經(jīng)元仍可調(diào)節(jié)睡眠-覺(jué)醒回路,明顯干擾了研究對(duì)Orexin 基因本身表達(dá)產(chǎn)生嗜睡的解釋[13-15]。2.1.2 OX2R/OX1R 基因敲除小鼠

Orexin 通過(guò)與G 蛋白偶聯(lián)受體(OX1R 和OX2R)結(jié)合,參與調(diào)節(jié)多種生理反應(yīng)。 在大腦皮層,OX1R 和OX2R 的mRNA 表達(dá)有明顯的晝夜節(jié)律[16-17]。 Willie 等[18]通過(guò)線性化載體的同源重組,在胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES)中用β 半乳糖苷酶(LacZ)和新霉素抗性(NEO)表達(dá)盒替換OX2R 基因第一個(gè)外顯子。 正確定向的ES 細(xì)胞克隆被分離并注射到C57BL/6J 囊胚中。 純合型小鼠無(wú)法檢測(cè)OX2R mRNA 表達(dá),在睡眠結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出輕度的REM 睡眠增加和猝倒發(fā)作,并出現(xiàn)清醒狀態(tài)下的NREM 睡眠侵入。 Kalogiannis 等[19]基于純合單受體基因敲除雜合子OX2R/OX1R 構(gòu)建雙重Orexin 受體基因敲除小鼠,表現(xiàn)出了較OX2R 基因敲除小鼠更強(qiáng)烈的發(fā)作性睡病表型,特征為頻繁發(fā)作的覺(jué)醒-睡眠轉(zhuǎn)換;REM 睡眠潛伏期縮短,時(shí)間延長(zhǎng);覺(jué)醒時(shí)間顯著減少并出現(xiàn)猝倒發(fā)作,其與Orexin基因敲除小鼠行為學(xué)相似。 對(duì)Hcrt 受體的遺傳操作是構(gòu)建發(fā)作性睡病模型的另一種方法。

2.2 轉(zhuǎn)基因模型

2.2.1 Orexin/Ataxin-3 轉(zhuǎn)基因小鼠

Ataxin-3 是脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3 型的疾病蛋白,多選用SD 大鼠或Wistar 小鼠建模。 Beuckmann研究小組首次構(gòu)建Orexin/Ataxin-3 mice,通過(guò)在prepro-orexin啟動(dòng)子后連接一段在N 端表達(dá)含有多聚谷氨酸片斷的ataxin-3 蛋白,在C 端連接用于組織學(xué)檢查的Myc癌基因序列,對(duì)尾部活檢組織的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并注射到Wistar 小鼠受精卵原核中,產(chǎn)成Orexin/Ataxin-3 轉(zhuǎn)基因系[20-21]。 由于Hcrt 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞毒基因產(chǎn)物PolyQ-ataxin-33 積累,Hcrt 神經(jīng)元逐漸選擇性地丟失。 17 周齡,用Myc 標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)基因小鼠下丘腦外側(cè)區(qū)出現(xiàn)Hcrt 陽(yáng)性神經(jīng)元喪失,在乳頭核、中央灰質(zhì)、穹隆周圍核、弓狀核等同樣缺乏Hcrt 投射。 在睡眠結(jié)構(gòu)上,模型小鼠表現(xiàn)出亮期REM 潛伏期縮短,暗期覺(jué)醒時(shí)間減少、REM 睡眠時(shí)間延長(zhǎng),覺(jué)醒-REM 轉(zhuǎn)換加快,但在24 h 的清醒和NREM 睡眠時(shí)間保持不變。 此模型中Hcrt 神經(jīng)元消融是漸進(jìn)性的,減輕了結(jié)構(gòu)性食欲素原基因敲除的代償作用,更能代表人類發(fā)作性睡病的病理改變。2.2.2 OX2R 轉(zhuǎn)錄干擾小鼠

OX2R 對(duì)Orexin-A 和Orexin-B 表現(xiàn)出同等的親和力,在大腦皮層、隔核、海馬、丘腦內(nèi)側(cè)核、中縫核和許多下丘腦核(包括組胺能結(jié)節(jié)乳頭核)中的表達(dá)顯著[22-23]。 基于Cre-loxP 重組[24],采用了轉(zhuǎn)錄干擾策略在EL250 細(xì)菌細(xì)胞中構(gòu)建靶向載體,使用loxP 側(cè)翼的基因盒來(lái)干擾OX2R 的產(chǎn)生,利用下丘腦結(jié)節(jié)乳頭核(tuberomammillary nucleus, TMN)神經(jīng)元orexin-A 細(xì)胞電生理反應(yīng)的缺失驗(yàn)證該菌株中OX2R 信號(hào)的缺失。 進(jìn)一步將編碼Cre 重組酶的腺相關(guān)病毒載體(AAV-Cre)注射到C57BL/6J 小鼠雙側(cè)顳下頜核區(qū),以確定局部恢復(fù)OX2R 表達(dá);并通過(guò)OX2R 轉(zhuǎn)錄干擾小鼠與雌性胚系中表達(dá)Cre 重組酶的Zp3-Cre 小鼠(jackson laboratory)雜交,完全恢復(fù)OX2R 信號(hào)[25]。 模型小鼠維持清醒的能力降低,表現(xiàn)為嗜睡和睡眠碎片化;與Orexin 敲除小鼠不同,OX2R 轉(zhuǎn)錄干擾小鼠只有罕見(jiàn)的猝倒發(fā)作。 用AAV-Cre 局部恢復(fù)TMN 神經(jīng)元和鄰近下丘腦后部的OX2R 后嗜睡癥狀有所減輕,但仍存在睡眠破碎。該模型制備過(guò)程是可逆的,可作為自身觀察對(duì)照,為NRL 的靶向治療提供思路,且為開(kāi)發(fā)食欲素受體拮抗劑用于失眠的治療提供了科學(xué)依據(jù)。

2.2.3 O/E3 轉(zhuǎn)錄因子缺失小鼠

O/E3 屬于堿性螺旋-環(huán)狀轉(zhuǎn)錄因子家族,通過(guò)控制必需的下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)及下丘腦神經(jīng)纖維的正常發(fā)育,在功能性Hcrt 能回路的建立過(guò)程中起著核心作用[26]。 研究發(fā)現(xiàn)O/E3 在NRL 和Hcrt 能群體退化的模型中表達(dá)下調(diào)[27]。 De La Herrán-Arita 等[28]使用pRVKI 載體來(lái)構(gòu)建O/E3 靶向構(gòu)建體,并用可選擇標(biāo)記PGK-neo 取代O/E3 基因的前5 個(gè)外顯子。 克隆一個(gè)3.2 kb 的O/E3 啟動(dòng)子區(qū)域的Xho IBamH I 片段,作為單純皰疹病毒酪氨酸激酶與pRVKI 的PGK-neo 選擇標(biāo)記之間的5’同源臂。 從O/E3 基因下游至第5 外顯子的5.3 kb的Spe I-Sal I 片段被克隆為pRVKI 載體pGK-neo 選擇標(biāo)記下游的3’同源臂。 再將PCR 和Southern 雜交檢測(cè)呈陽(yáng)性,并攜帶正確的靶向插入的ES 細(xì)胞注射到C57BL/6NCr1 小鼠囊胚中,獲得O/E3 缺失的純合子小鼠。 其表現(xiàn)出REM、NREM 睡眠時(shí)間延長(zhǎng),REM 潛伏期縮短,暗期覺(jué)醒時(shí)間減少,出現(xiàn)睡眠幻覺(jué)及厭食癥狀。 免疫組化染色發(fā)現(xiàn),O/E3 缺失導(dǎo)致下丘腦Hcrt 細(xì)胞數(shù)量顯著減少,局限于后部及穹隆周圍區(qū)域。 腦橋食欲素能神經(jīng)支配受損,通過(guò)靜脈注射Hcrt-1 可逆轉(zhuǎn)發(fā)作性睡病表型[29]。 此模型突出了轉(zhuǎn)錄因子在控制睡眠-覺(jué)醒周期的神經(jīng)亞群調(diào)節(jié)中的重要性,為理解復(fù)雜的食欲素神經(jīng)元電路開(kāi)辟了新的選擇。

3 化學(xué)誘導(dǎo)動(dòng)物模型

3.1 白喉毒素A(diphtheria toxin chain A, DTA)誘導(dǎo)模型

白喉毒素是一種具有高度免疫原性的蛋白質(zhì),可導(dǎo)致生物神經(jīng)脫髓鞘。 基于Tet-off 調(diào)控系統(tǒng)控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的技術(shù),將白喉毒素受體基因特定表達(dá)于小鼠Hcrt 啟動(dòng)子上,構(gòu)建Teto DTA 小鼠。 用哺乳動(dòng)物四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活因子(tetracyclinecontrolled transactivator, TTA)片段取代Hcrt/nLacZ轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的nLacZ基因,并注射到Teto DTA 小鼠受精卵(C57BL/6 小鼠)的原核中,通過(guò)C57BL/6J 小鼠培育出穩(wěn)定的Hcrt-TTA 轉(zhuǎn)基因品系[30]。Hcrt 神經(jīng)元變性由四環(huán)素反式激活因子Tet-off(Teto) 系統(tǒng)控制的,膳食多西環(huán)素(doxcycline,DOX)與TTA 結(jié)合,通過(guò)Tet-off 調(diào)節(jié)蛋白阻止DTA的合成。 由于TTA 被連接到Hcrt 啟動(dòng)子上,從飲食中去除DOX 會(huì)啟動(dòng)DTA 的合成,僅在Hcrt 神經(jīng)元中產(chǎn)生神經(jīng)毒性[31-32]。 配對(duì)的Hcrt-TTA 小鼠和Teto DTA 小鼠進(jìn)行交配產(chǎn)生Hcrt-TTA/Teto DTA 小鼠,將10% DOX 粉添加入正常飼料,在產(chǎn)前和出生后12 周內(nèi)使用含DOX 飼料喂養(yǎng),后換成普通飼料喂養(yǎng)至14 周,再重復(fù)用DOX 飼料喂養(yǎng)至25 周。 在睡眠結(jié)構(gòu)上,在去除DOX 飲食后14 d,Hcrt-TTA/Teto DTA 小鼠出現(xiàn)頻繁猝倒發(fā)作,主要發(fā)生在暗期及亮期的覺(jué)醒前期;REM 潛伏期縮短、睡眠時(shí)間延長(zhǎng);睡眠-覺(jué)醒轉(zhuǎn)換次數(shù)增加。 行為學(xué)上,表現(xiàn)為進(jìn)食量無(wú)改變,但運(yùn)動(dòng)減少,體重增加。 DAT 誘導(dǎo)模型可通過(guò)比較同一個(gè)體動(dòng)物在Hcrt 神經(jīng)元消融之前、期間和之后的行為和生理學(xué),來(lái)研究Hcrt 神經(jīng)元消融過(guò)程中NRL 的癥狀進(jìn)展;且Hcrt 神經(jīng)退行性病變?cè)谇啻浩谇昂笳T導(dǎo),更符合人類NRL 的發(fā)病進(jìn)程。 模型小鼠體重增加,但食物攝入未改變,這與人類NRL 代謝表現(xiàn)類似。 實(shí)驗(yàn)者可自行控制Hcrt 神經(jīng)元消融時(shí)間和持續(xù)時(shí)間,可用于猝倒的藥理學(xué)研究,在Hcrt 神經(jīng)輸入受限時(shí)的網(wǎng)絡(luò)重組研究。

3.2 核糖體失活蛋白(saporin, SAP)誘導(dǎo)模型

將內(nèi)源性配體Hcrt2 與SAP 偶聯(lián),構(gòu)建Hcrt2-sAP 神經(jīng)毒素。 研究證實(shí)Hcrt2-sAP 可與含有HcrtR2 受體特異性結(jié)合,向大鼠下丘腦外側(cè)核注射Hcrt2-sAP 可破壞Hcrt 神經(jīng)元,從而減少腦脊液中Hcrt 含量,誘導(dǎo)大鼠的發(fā)作性睡病行為[33]。 Blanco-Centurion 等[34]利用Hcrt2-sAP,將其分別注入大鼠下丘腦外側(cè)和腹側(cè)0.5 mm 處,當(dāng)Hcrt2-sAP 應(yīng)用于下丘腦外側(cè)時(shí),受損大鼠出現(xiàn)NRL 表型;而損傷內(nèi)側(cè)隔區(qū)Hcrt 受體神經(jīng)元并未觀察到NRL 癥狀。 嗜睡大鼠表現(xiàn)出REM/NREM 睡眠時(shí)間延長(zhǎng);肌張力增加且出現(xiàn)廣泛的肢體運(yùn)動(dòng)。 Arias-Carrión 等[35]對(duì)此模型大鼠進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)73% Hcrt 受體神經(jīng)元被成功損毀時(shí),腦脊液中Hcrt 水平降低50%。 并利用睡眠剝奪法檢測(cè)下丘腦增食欲素表達(dá),來(lái)測(cè)試睡眠調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制,結(jié)果顯示在損傷后6 h,增食欲素水平未見(jiàn)增加。 Hcrt2-sAP 誘導(dǎo)模型可通過(guò)靶向損傷受體神經(jīng)元,闡明特定的Hcrt 神經(jīng)支配在睡眠-覺(jué)醒行為中的作用,為探索移植作為NRL的治療手段提供了思路。 但由于Hcrt2-sAP 可消融其他表達(dá)食欲素受體的LH 細(xì)胞群體,包括黑色素濃縮激素神經(jīng)元和含腺苷脫氨酶的神經(jīng)元等[36-37],所以此類模型與人類NRL 的發(fā)病機(jī)制存在差異。

3.3 硝基還原酶-甲硝唑誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)模型

Hcrt 能神經(jīng)元在斑馬魚(yú)中表現(xiàn)出調(diào)節(jié)睡眠和清醒行為的雙重功能[38]。 Elbaz 等[39]將大腸桿菌的硝基還原酶B(nitroreductase B, nfsB)轉(zhuǎn)基因特異性表達(dá)于Hcrt 能神經(jīng)元中,構(gòu)建了時(shí)空可控的Hcrt能神經(jīng)元消融的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型。 硝基還原酶通過(guò)將無(wú)害的前體藥物甲硝唑(metronidazole,MET)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂卸拘缘漠a(chǎn)物,對(duì)Hcrt 神經(jīng)元進(jìn)行消融[40-41]。 模型表現(xiàn)出白天REM 睡眠時(shí)間延長(zhǎng),睡眠-覺(jué)醒轉(zhuǎn)換次數(shù)增加,對(duì)外部刺激反應(yīng)性降低。由于斑馬魚(yú)Hcrt 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)只由20 ～60 個(gè)腦神經(jīng)元組成,因此造模簡(jiǎn)單,易于操作[42],但與人類在解剖結(jié)構(gòu)、生理反應(yīng)上均存在較大差異。

4 光遺傳學(xué)模型

Williams 等[43]在食欲素原啟動(dòng)子下游插入修飾的Arch-3 gene,用1.5 kb 的Arch 片段替換Hcrt/nLacZ 構(gòu)建體的LacZ基因,將其表達(dá)為與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluoresce protein,EGFP)的融合蛋白,從而獲得轉(zhuǎn)基因載體。 將轉(zhuǎn)基因顯微注射到BDF1 小鼠受精卵的原核中并培育出穩(wěn)定的Hcrt/Arch 轉(zhuǎn)基因品系,黃色光敏Arch-3 質(zhì)子泵在Hcrt 神經(jīng)元中發(fā)揮特異性抑制作用。 利用抗EGFP 抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)雙標(biāo),證實(shí)Arch 在Hcrt 神經(jīng)元中的表達(dá)。 通過(guò)對(duì)該模型小鼠進(jìn)行光照可以誘導(dǎo)潛伏期較短的睡眠,但誘導(dǎo)效果與轉(zhuǎn)基因表達(dá)程度有關(guān)。 高水平Arch 表達(dá)影響了Hcrt 神經(jīng)元興奮性,模型小鼠表現(xiàn)出REM/NREM 潛伏期縮短,REM 睡眠延長(zhǎng),覺(jué)醒時(shí)間減少。 Hcrt/Arch 小鼠允許對(duì)Hcrt 神經(jīng)元進(jìn)行短期、可逆的操作,便于評(píng)估Hcrt 神經(jīng)回路的特定方面及Hcrt 激活或抑制的后果。

5 免疫介導(dǎo)模型

5.1 脂多糖誘導(dǎo)的CCR3 基因敲除模型

趨化因子受體3(chemokine receptor 3, CCR3)是與發(fā)作性睡病相關(guān)的易感基因,其在發(fā)作性睡病患者外周血中的表達(dá)水平降低[44]。 CCR3 作為一種G 蛋白偶聯(lián)受體,調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的定位及炎癥細(xì)胞分泌的趨化因子梯度,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為炎癥介質(zhì)發(fā)揮作用[45]。 Toyoda 等[46]發(fā)現(xiàn)與WT 小鼠相比,CCR3 基因敲除小鼠的Hcrt 神經(jīng)元數(shù)量減少約10%,未產(chǎn)生發(fā)作性睡病的表現(xiàn)。 進(jìn)一步使用革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作為免疫系統(tǒng)刺激物,腹腔注射入CCR3 基因敲除小鼠,小鼠出現(xiàn)REM 睡眠時(shí)間延長(zhǎng),NREM 睡眠時(shí)間縮短而發(fā)作次數(shù)增加。多項(xiàng)研究證實(shí),LPS 能在給藥后24 h 內(nèi)改變嚙齒動(dòng)物的睡眠-覺(jué)醒模式[47-49]。 LPS 誘導(dǎo)的CCR3 基因敲除小鼠適用于研究由環(huán)境觸發(fā)因素引起免疫介導(dǎo)的Hcrt 神經(jīng)元退化,來(lái)理解發(fā)作性睡病的免疫發(fā)病背景。

5.2 CD8+T 介導(dǎo)的Hcrt 神經(jīng)元損傷模型

發(fā)作性睡病與人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)等位基因HLA-DQB1*06:02 密切相關(guān),98.4%的患者攜帶該基因,在發(fā)作性睡病患者的血清和腦脊液中已發(fā)現(xiàn)識(shí)別中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)不同抗原靶點(diǎn)的自身抗體[50-52]。 Bernard-Valnet 等[53]培育了在Hcrt 能神經(jīng)元(稱為Orex-HA)中特異性表達(dá)血凝素(hemagglutinin, HA)作為“新自身抗原”的小鼠,將Rosa26tm(HA)1lib 小鼠與Orex-Cre 小鼠雜交,在人食欲素啟動(dòng)子的控制下表達(dá)Cre,通過(guò)定量RT-PCR 方法檢測(cè)評(píng)估HA 在Orex-HA 小鼠大腦不同部位的轉(zhuǎn)錄情況。 然后將自身抗原特異性的CD8+T(CTL)細(xì)胞注射到Orex-HA小鼠體內(nèi),組織學(xué)分析顯示Orex-HA 小鼠下丘腦有密集的T 細(xì)胞浸潤(rùn),在移植后第5 ～8 天達(dá)到高峰。15 d 后再次接受CTL,迅速出現(xiàn)明顯的發(fā)作性睡病表型,包括猝倒發(fā)作,REM 潛伏期縮短、時(shí)間延長(zhǎng),覺(jué)醒次數(shù)減少。 CTL 與表達(dá)MHC-I 類Hcrt 神經(jīng)元直接相互作用,導(dǎo)致細(xì)胞溶解顆粒極化,反復(fù)注射CTL 后,這種表型進(jìn)一步加重[54]。 該模型適用于發(fā)作性睡病的自身免疫發(fā)病機(jī)制研究,且為探究免疫療法提供了理論基礎(chǔ)。

6 總結(jié)

NRL 是一種具有遺傳易感性、受環(huán)境因素影響或觸發(fā)的疾病,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。 動(dòng)物模型是研發(fā)和測(cè)試新的NRL 療法的基礎(chǔ)。 目前已開(kāi)發(fā)的動(dòng)物模型主要通過(guò)基因工程或化學(xué)誘導(dǎo)等方法,造成下丘腦外側(cè)區(qū)Hcrt 神經(jīng)元特異性喪失,以模擬人類NRL的病理表現(xiàn)和臨床特征,但由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類在基因調(diào)控、器官結(jié)構(gòu)與細(xì)胞類型等存在一定差別,這些模型對(duì)NRL 治療靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)能力有限,仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。 如在O/E3 轉(zhuǎn)錄因子缺失模型中,通過(guò)靜脈注射Hcrt-1 可逆轉(zhuǎn)NRL 表型,但對(duì)于人類NRL患者使用Hcrt 神經(jīng)肽并不可行,因其很難穿越血腦屏障[55]。 NRL 治療發(fā)展的最終目標(biāo)應(yīng)是研發(fā)出一種針對(duì)該病病因,即自身免疫介導(dǎo)的下丘腦外側(cè)區(qū)Hcrt 神經(jīng)元退化。 因此,可進(jìn)一步構(gòu)建由自身免疫介導(dǎo)的NRL 動(dòng)物模型,更準(zhǔn)確地了解免疫系統(tǒng)對(duì)NRL 患者Hcrt 系統(tǒng)毀損的病理機(jī)制,從而為預(yù)防、治療或阻止NRL 的發(fā)作提供相應(yīng)的治療靶點(diǎn)。

綜上,雖然目前的動(dòng)物模型不能完全概括人類發(fā)作性睡病的所有特征,但在揭示發(fā)作性睡病復(fù)雜病理機(jī)制及潛在治療策略等方面,動(dòng)物模型發(fā)揮了關(guān)鍵作用。 需要強(qiáng)調(diào)的是,動(dòng)物模型應(yīng)是人體復(fù)雜系統(tǒng)的簡(jiǎn)單表示,模擬疾病的特定方面,而決不是試圖復(fù)制人類疾病的所有復(fù)雜性。 每個(gè)模型的優(yōu)勢(shì)很大程度上取決于該模型的評(píng)估目的,未來(lái)仍需基于研究目的繼續(xù)探索更合適的動(dòng)物模型。