張曉梅， 黃木圣， 范春嬌， 林星陽(yáng) ， 高松林， 黃貴華

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 南寧 530023)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種目前病因不明確的結(jié)腸和直腸的慢性非特異性炎癥性疾病,主要包括腹痛、腹瀉、黏液膿血便和里急后重等臨床表現(xiàn),其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，但產(chǎn)生此疾病的具體病因及發(fā)病機(jī)制尚不完善1、2]。因此，需要制作UC動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,以期深入研究其發(fā)病機(jī)制。本文就幾種常用潰瘍性結(jié)腸炎模型的造模方法、方法評(píng)價(jià)等進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為實(shí)驗(yàn)研究選擇較理想的造模方法提供理論支持。

1 UC動(dòng)物模型的制作方法

1.1 免疫法

1.1.1 結(jié)腸黏膜組織致敏法 此方法將Frend佐劑(弗氏佐劑)加入大鼠或者其他動(dòng)物的結(jié)腸黏膜組織制作的勻漿中，然后每只大鼠足墊內(nèi)的部位注射上述混合液的上清液，劑量為0.1～0.3 mL，時(shí)間分別為第1天和第15天。當(dāng)?shù)?7、24、30天時(shí)分別在大鼠的背部、腹股溝及腹腔內(nèi)注射同樣的上清液(劑量也同上)，但是第30天注射時(shí)不加Frend佐劑，當(dāng)腹腔注射5 d后，可以明顯觀察到大鼠出現(xiàn)UC樣癥狀，并取其結(jié)腸組織進(jìn)行病理檢測(cè)[3，4]。

該模型的穩(wěn)定性好, 臨床相近度高,得出的結(jié)果更接近實(shí)際,可以應(yīng)用于抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物的篩選實(shí)驗(yàn)。此方法的制作過(guò)程相對(duì)其他方法復(fù)雜, 造模時(shí)間長(zhǎng)，可復(fù)制性較差，且成功的關(guān)鍵在于Frend佐劑的配制，因此需要相應(yīng)的條件、設(shè)備及掌握相關(guān)的技術(shù),否則難以達(dá)到實(shí)驗(yàn)想要的效果, 所以目前實(shí)驗(yàn)研究較少應(yīng)用此類(lèi)方法。

1.1.2 胎鼠結(jié)腸種植法 該方法在無(wú)菌條件下將抗原(胎鼠結(jié)腸)手術(shù)移植于成年鼠(同系)的腎包膜下，手術(shù)完成后，正常飼養(yǎng)20 d，然后取其結(jié)腸組織觀察其病理改變[5]。

本方法的產(chǎn)生原理是細(xì)胞免疫反應(yīng)(宿主抗移植反應(yīng))，制作出來(lái)的模型臨床相似度高，當(dāng)進(jìn)行防治潰瘍性結(jié)腸炎的免疫藥理學(xué)研究時(shí)，可將其作為較為理想的動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)需要無(wú)菌操作，且周期長(zhǎng)、技術(shù)難度大且有局限性，成功率低，因此較少應(yīng)用[6]。

1.1.3 大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株法 實(shí)驗(yàn)選擇正常大鼠腸道的大腸桿菌作為抗原,將其注入實(shí)驗(yàn)大鼠體內(nèi),使大鼠發(fā)生免疫反應(yīng), 從而大鼠結(jié)腸壁表現(xiàn)出潰瘍或炎癥反應(yīng)[7]。

此造模方法過(guò)程簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉, 與人UC的臨床表現(xiàn)相似且容易成功，是較理想的病因?qū)W研究模型。實(shí)驗(yàn)需要制備大腸桿菌混懸液且周期長(zhǎng)，因此只適合于有技術(shù)條件的實(shí)驗(yàn)者[8]。

1.2 化學(xué)法

1.2.1 葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)自由飲 袁權(quán)利等[9]采用2% DSS溶液代替飲用水，第1周、第2周后均腹腔注射1次15 mg/kg AOM，即可成功造成UC模型。陳素傲等[10]采用2%～5%DSS溶液飲用5～7 d可制成急性UC模型，反復(fù)周期性給予DSS溶液則可誘導(dǎo)慢性UC模型。王亞梅等[11]采取自由灌喂的方式,讓小鼠連續(xù)2周飲用濃度為4%的DSS溶液, 建立慢性UC的模型。

此方法操作不復(fù)雜容易得出結(jié)果，且臨床相似度、可重復(fù)性高。但是大鼠飲用DSS的量無(wú)法準(zhǔn)確控制，從而導(dǎo)致組內(nèi)大鼠病變差異大[12]。

1.2.2 乙酸(acetic acid,AA) 楊永剛等[13]采取腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉的方式對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，然后將直徑3 mm的灌腸硅膠管經(jīng)其肛門(mén)緩慢插入約8 cm，緩慢注入1.5 mL 10%的乙酸溶液，10～15 s后生理鹽水灌腸清洗，即建模完成。張勇等[14]采取腹腔注射300 mg/kg水合氯醛的方式對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，然后將直徑2 mm的灌腸硅膠管經(jīng)其肛門(mén)緩慢插入約8 cm，緩慢注入1 mL 8%的乙酸溶液，10～15 s后生理鹽水灌腸清洗，即建模完成。

其操作方法簡(jiǎn)單，材料來(lái)源方便、成本低，因此應(yīng)用廣泛。乙酸刺激后該模型容易發(fā)生自愈, 比較適用于研究急性UC模型的藥物療效和黏膜愈合機(jī)制，但在研究免疫機(jī)理、藥物藥效等方面不適用[15]。

1.2.3 惡唑酮(oxazolone,OXZ) 王艷紅等[16]制作方法總結(jié)如下：首先對(duì)小鼠注射乙醚麻醉，然后在小鼠肛門(mén)插入硅膠管深4 cm,注入150 μL唑酮 (6 mg溶于50%乙醇中)于硅膠管，讓其緩慢流入小鼠體內(nèi)。此操作完成后，為防止漏液將小鼠倒放30 s即可。周瑾等[17]將0.3 mL 3%的惡唑酮(溶于100%乙醇溶液中)涂抹在腹部(剃毛)，隔天再涂抹1次，然后禁食不禁水24 h后進(jìn)行麻醉，再?gòu)母亻T(mén)注入0.3 mL 1%的惡唑酮溶液(溶于50%乙醇中)，倒置大鼠60 s，按壓其肛門(mén)口約2 min，讓其自然清醒，正常飼養(yǎng)1 d后，重復(fù)上述灌腸操作。

其制作簡(jiǎn)單，容易掌握，可復(fù)制性強(qiáng)、成本低。病情不持續(xù)，自愈性強(qiáng),沒(méi)有慢性炎癥的表現(xiàn), 因此不能用于慢性潰瘍性結(jié)腸炎的研究[18]。

1.2.4 角叉菜膠 在研究對(duì)象飲水中加入3%～5%降解的角叉菜膠水溶液，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，研究對(duì)象產(chǎn)生UC模型的典型癥狀[19]。

其方法簡(jiǎn)單，容易操作，腸道炎癥表現(xiàn)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，能夠很好地詮釋疾病的慢性病程。病變反應(yīng)多發(fā)生在盲腸，臨床癥狀持續(xù)時(shí)間短，此方法在實(shí)際操作中多用豚鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象且需要反復(fù)造模，因此代價(jià)高昂，故目前臨床多不采用此方法造模[20]。

1.3 復(fù)合法

1.3.1 三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)/乙醇誘導(dǎo) 江巧麗等[21]先將小鼠禁食不禁水24 h,再注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，然后將橡膠軟管插入小鼠肛門(mén)深8 cm，將混合液(0.6 mL TNBS+ 0.25 mL乙醇溶液)注入橡膠軟管，將小鼠倒立30 s(防止漏液)后，平放使其自然恢復(fù)，即制成UC模型。黎笑蘭等[22]給大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，橡膠軟管從肛門(mén)插入至距肛門(mén)8 cm處，緩慢注入0.8 mL的三硝基苯磺酸(溶于50%乙醇中)，讓液體緩慢流入小鼠體內(nèi)，此操作完成后，為防止漏液將小鼠倒放30 s即可。劉喜平等[23]采用腹腔注射7%水合氯醛進(jìn)行麻醉后，在石蠟油潤(rùn)滑的情況下，將橡膠軟管經(jīng)腸道緩插8 cm入結(jié)腸，然后推入0.8 mL 的藥物(100 mg/kg的TNBS與等體積50%乙醇混合)，再注入0.5 mL空氣,將大鼠倒置1 min防止漏液，然后等其自然醒,每周1次,連續(xù)5周，即造模完成。李盼盼等[24]用4%水合氯醛進(jìn)行麻醉，將經(jīng)過(guò)石蠟油潤(rùn)滑后的硅膠管由肛門(mén)緩慢插入深8 cm，緩慢注入約1 mL 100 mg/kg 的TNBS溶液(溶于50%乙醇溶液中)，倒置大鼠60 s按壓其肛門(mén)口，即建立潰瘍性結(jié)腸炎的模型。劉佳麗等[25]實(shí)驗(yàn)證明，不同造模次數(shù)造成大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的效果不同。結(jié)果表明，持續(xù)3次采取100 mg/kg TNBS+乙醇溶液對(duì)大鼠進(jìn)行灌腸更容易成功建立UC模型。

TNBS/乙醇誘導(dǎo)是大家比較認(rèn)可、應(yīng)用最廣泛的方法之一,其操作簡(jiǎn)單,臨床相似度高，可復(fù)制性強(qiáng), 病情持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、成本低，慢性炎癥表現(xiàn)比較明顯，為探索新的慢性炎癥治療藥物提供了條件。

1.3.2 乙酸復(fù)合刺激法 盧倩等[26]、徐雨生等[27]則選擇異體抗原聯(lián)合醋酸的方法進(jìn)行UC造?！，F(xiàn)配制異體抗原乳化劑，然后在大鼠左側(cè)足跖、右側(cè)足趾、腹股溝、背部皮下、腹腔分別注射0.1 mL上述試劑(其中成分包含8 mg抗原以及0.05 mL完全Frend佐劑)，時(shí)間分別為第1、8、15、22、29天 ，第29天注射時(shí)不加佐劑。上述操作完成后大鼠禁食不禁水24 h，然后大鼠用1 mL 5%的醋酸溶液進(jìn)行灌腸,溶液在大鼠體內(nèi)停留30 s后,用4 mL氯化鈉溶液沖洗腸道，再用1 mL異體抗原乳化劑重復(fù)灌腸。同樣將液體留置體內(nèi)，時(shí)間為30 min，并重復(fù)上述沖洗步驟，即造模完成。

此方法造出的模型具有免疫異常、局部炎癥等2種表現(xiàn)且成功率高，可復(fù)制性強(qiáng)，死亡率低，適合與UC相關(guān)的研究。該過(guò)程復(fù)雜、操作困難、難以掌握且周期長(zhǎng)，故當(dāng)前研究較少選擇此類(lèi)方法。

1.3.3 二硝基氯苯(DNCB)/乙酸誘導(dǎo) 陳夢(mèng)夢(mèng)等[28]UC造模方法如下：首先制備20 g/L的2,4-二硝基氯苯丙酮液、0.1%的2,4-二硝基氯苯乙醇等液體，在每只大鼠脫毛處(大鼠背部)給予0.3 mL 的2,4-二硝基氯苯丙酮液，每日1次，重復(fù)上述操作14 d。第15天將聚乙烯導(dǎo)管插入肛門(mén)深8 cm，并注入0.25 mL 0.1%的 2,4-二硝基氯苯乙醇溶液于管道，讓溶液流入動(dòng)物體內(nèi)；第16天從管道再次注射2 mL 80 mL/L的醋酸溶液，15 s后用生理鹽水沖，即造模完成。張艷曉等[29]造模方法如下：首先大鼠禁食36 h(不禁水)，在每只大鼠背部脫毛處先一層涂豬油，再給予0.3 mL的2% DNCB丙酮液，每日1次，重復(fù)上述操作14 d。第30天將聚乙烯導(dǎo)管插入肛門(mén)深8 cm，并注入0.3 mL 0.1%的 2,4-二硝基氯苯乙醇溶液于管道，第31天再次從管道注射2 mL 0.2%的醋酸溶液，15 s后用生理鹽水沖，即造模完成。

模型臨床表現(xiàn)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，與人UC相似度高，造模容易成功且重復(fù)性高。整個(gè)過(guò)程非常繁瑣,造模時(shí)間長(zhǎng)且DNCB有毒,容易導(dǎo)致動(dòng)物死亡。

1.4 中醫(yī)證型動(dòng)物模型法

王愛(ài)華等[30]、劉香玉等[31]建立脾腎陽(yáng)虛型UC模型，分別用番瀉葉灌胃+氫化可的松腹腔注射和大黃水煎液灌胃+氫化可的松肌注的方式，但都采取TNBS/乙醇誘導(dǎo)法建立UC大鼠模型。柳榮等[32]總結(jié)肝郁脾虛型UC模型建立方法中提出束縛法+飲食失節(jié)刺激+TNBS/乙醇誘導(dǎo)的方式比較好并有兩種方式：第一種是先限制飲食行動(dòng)后，再采用TNBS/乙醇誘導(dǎo)法進(jìn)行灌腸；第二種是先限制飲食行動(dòng)1周后，通過(guò)TNBS/乙醇混合液灌腸造模，然后再進(jìn)行限制飲食行動(dòng)2周。姜小艷等[33]雙日給予大鼠豬油(4 mL 1只,每日1次)，每天將大鼠站立在2 cm的水里并保持8 h，持續(xù)20 d，第21天采取TNBS/乙醇誘導(dǎo)法進(jìn)行造模，此方法統(tǒng)一稱為“內(nèi)外因+三硝基苯磺酸”(TNBS)法。石磊等[34]建造寒熱錯(cuò)雜證UC大鼠模型方法，大鼠禁食不禁水24 h后進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉后將經(jīng)過(guò)潤(rùn)滑后的乳膠軟管插入肛門(mén)(深8 cm),隨后1 min內(nèi)推入0.6 mL的藥物(100 mg/kg的TNBS與33. 3%乙醇混合)，讓大鼠仰臥位保持15 min后使其自然清醒，此操作每天1次，持續(xù)3 d。

中醫(yī)證型動(dòng)物模型(脾腎陽(yáng)虛型、肝郁脾虛型、寒熱錯(cuò)雜證等)能夠更好地體現(xiàn)UC的西醫(yī)病理和中醫(yī)病機(jī)等特點(diǎn)，也更適合藥效的觀察與評(píng)價(jià)，但是此模型只復(fù)制了一部分證候表現(xiàn)，中醫(yī)診斷疾病的重要指征(舌象、脈象等)無(wú)法在模型中得到體現(xiàn)。雖然目前中醫(yī)證型動(dòng)物模型法是較為合理的一種，但僅以部分臨床表現(xiàn)作為判斷依據(jù)，其模型評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)仍不夠客觀與合理。因此，為建立更符合人類(lèi)疾病的中醫(yī)證型動(dòng)物模型，仍需要進(jìn)一步的探討[35]。

1.5 其他造模方法

潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型除以上列舉的造模方法之外，還有DNCB或者TNBS誘導(dǎo)法、DSS復(fù)合法、惡唑酮+乙醇誘導(dǎo)法、自發(fā)模型法、基因模型法、細(xì)菌感染法等，其中DNCB或者TNBS誘導(dǎo)法是化學(xué)法的一種，而DSS復(fù)合法、惡唑酮+乙醇誘導(dǎo)法則屬于復(fù)合法。TNBS單獨(dú)誘導(dǎo)法的操作方法如下[36]：小鼠禁食24 h(不禁水)，然后采用10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉(0.25 mL/100 g)，麻醉后直接用灌胃針將TNBS溶液注入動(dòng)物腸腔內(nèi)，并將其倒立1 min即可。此方法的優(yōu)點(diǎn)是操作方便，重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)周期短且成本低，而缺點(diǎn)是TNBS溶液的劑量不好掌控，當(dāng)TNBS的量過(guò)小時(shí)自愈性強(qiáng)，炎癥時(shí)間短，而TNBS的量過(guò)大時(shí)，其死亡率高。DNCB誘導(dǎo)法建立的UC模型具有自愈性強(qiáng)等特性,有實(shí)驗(yàn)證明DNCB加乙酸能夠克服DNCB造成的動(dòng)物自愈性，因此臨床大多采用DNCB加乙酸的方法建立UC模型。

DSS復(fù)合法建立的UC模型與人類(lèi)極其相似，但是因?yàn)镈SS的成本過(guò)高，妨礙此方法的推廣。惡唑酮+TNBS誘導(dǎo)法建立的模型雖然克服了單獨(dú)使用TNBS誘導(dǎo)時(shí)模型出現(xiàn)局部炎癥輕的缺點(diǎn)，又彌補(bǔ)了單獨(dú)使用OXZ誘導(dǎo)時(shí)動(dòng)物出現(xiàn)炎癥反應(yīng)不持續(xù)的不足，但其操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，由此臨床較少應(yīng)用。

自發(fā)模型法建立的模型因?yàn)槠浼膊∽园l(fā)的特點(diǎn)，成為最貼近UC的模型，但是因?yàn)閬?lái)源稀少，成本高昂，限制了此造模方法的實(shí)際應(yīng)用?；蚰Ｐ头ń⒌哪Ｐ桶蚯贸汀⑥D(zhuǎn)基因型等?；騽?dòng)物模型對(duì)研究疾病的發(fā)生機(jī)制、病因以及藥物治療效果具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，但是需要較高的技術(shù)支撐且代價(jià)昂貴，因此還在進(jìn)一步研究中，臨床上應(yīng)用不多。

2 結(jié)語(yǔ)

綜上所述, 潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的建立方法大概包括免疫法、化學(xué)法、復(fù)合法、中醫(yī)證型動(dòng)物模型法，以及自發(fā)模型法、基因模型法、細(xì)菌感染法等，上述每個(gè)方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，臨床研究大多采用化學(xué)法和復(fù)合法，其中尤以乙酸法、DSS自由飲和TNBS/乙醇誘導(dǎo)法最為常用。免疫法、自發(fā)模型法、基因模型法、細(xì)菌感染法等均存在技術(shù)要求高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，由此臨床多不采用此類(lèi)方法。根據(jù)中醫(yī)理論病證結(jié)合方法建立的中醫(yī)證候模型，體現(xiàn)了UC的西醫(yī)病理和中醫(yī)病機(jī)，是目前比較合理的一種造模方法，但仍然不夠全面，但隨著模型研究的深入及想法的不斷創(chuàng)新，此方法將被更多人承認(rèn)，也會(huì)為以后的中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究的前進(jìn)提供支持，期望在未來(lái)能更多地從病證結(jié)合角度發(fā)展UC模型的建立以及治療。前期的模型建立對(duì)實(shí)驗(yàn)是否成功起著至關(guān)重要的作用。判斷模型成功的方法，如肉眼觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否發(fā)生腹瀉、便血等病癥，臨床檢測(cè)包括糞便檢查、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、內(nèi)鏡檢查、免疫學(xué)檢測(cè)等，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)則包括DAI、MPO、結(jié)腸病理組織檢查等?，F(xiàn)實(shí)中由于多種原因的限制，前期實(shí)驗(yàn)必須對(duì)動(dòng)物的造模方式進(jìn)行選擇。由此本文就UC造模方法進(jìn)行分析，以期為實(shí)驗(yàn)研究選擇較理想的造模方法提供理論支持。