閆鳳霞， 楊 玲， 溫賢將， 郭 睿， 郭旭凱， 段 冰， 邵 強， 柳青山

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高粱研究所，山西晉中 030600）

高粱作為一種新型健康雜糧，越來越受到養(yǎng)生人士的青睞（楊玲等，2021）。高粱籽粒營養(yǎng)特別豐富，其中蛋白質(zhì)、微量元素、膳食纖維等含量均高于其他谷物，蛋白質(zhì)所含氨基酸種類較齊全，能為人類和動物生長發(fā)育提供所需的基本營養(yǎng)（馮紅紅，2021）。高粱籽粒中含有許多次生代謝產(chǎn)物和內(nèi)源性物質(zhì)，如固醇、酚類物質(zhì)、多烷醇等，其中一些功能性成分能夠減少慢性疾病的危害，如機體高血糖、心腦血管等代謝病，對慢病具有很好預(yù)防作用。高粱中的單寧原花青素是一類酚類化合物，是類黃酮的一個亞類，該物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗關(guān)節(jié)炎活性，并在預(yù)防心臟病、皮膚老化和各種癌癥中發(fā)揮重要作用（蔣依然，2020；Dykes Linda，2019；閆慧詩等，2018）。目前，高粱已成為功能食品及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點（謝甜等，2021；陳華敏，2018；Shen等，2018；王堅強等，2017；Gowd等，2017）。

腸道微生物參與動物機體的營養(yǎng)代謝和免疫應(yīng)答，對宿主生長發(fā)育具有重要影響（孫鐵虎等，2021；徐曉鋒等，2019；Kim等，2018）。動物腸道微生物組因其數(shù)量龐大，組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點，成為近幾年人們重點關(guān)注的內(nèi)容。研究表明，腸道微生物群落結(jié)構(gòu)受遺傳、飲食和地理環(huán)境等因素影響，其中飲食是影響腸道微生物的主要因素（任彩君等，2021；任世恩等，2020；索效軍等，2019；盧烽等，2018）。高粱飼喂畜禽的研究大都集中在生產(chǎn)性能等方面，而對腸道菌群的影響卻鮮見報道。隨著DNA測序技術(shù)與生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，對腸道微生物的菌群多樣性、菌群功能、群落結(jié)構(gòu)等方面的研究已經(jīng)越來越離不開高通量測序技術(shù)。高通量測序已經(jīng)應(yīng)用于很多領(lǐng)域，其克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定的工作量大、耗時長的缺點，可以快速、準確的檢測大批量樣本，從基因水平準確鑒定微生物的分類及種群關(guān)系，是研究腸道菌群的重要手段（黃志強等，2021）。該研究旨在通過16SrDNA高通量測序的方法，研究不同飼糧條件下蛋雞腸道細菌多樣性及菌群結(jié)構(gòu)差異，初步探索高粱對蛋雞腸道微生物的影響效果。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 試驗采用單因子完全隨機區(qū)組設(shè)計，將120只健康、體重均勻、日齡150 d的海蘭褐蛋雞隨機分為兩組，分別飼喂玉米日糧和高粱日糧，玉米組飼糧為60%玉米，40%蛋雞濃縮料；高粱組飼糧為60%高粱，40%蛋雞濃縮料。試驗期5個月。供試雞群按常規(guī)飼養(yǎng)方法管理，每天飼喂3次，自由采食飲水。

1.2 指標測定 試驗期內(nèi)觀察每組雞只健康狀況，記錄每組產(chǎn)蛋量、耗料量和蛋重指標。試驗中期隨機抽取每組10只雞采血取樣，檢測血液中膽固醇等指標。甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 糞便總DNA提取和高通量測序 每組隨機選取6只蛋雞，在試驗?zāi)┢诜謩e采集雞只新鮮糞樣20 g，裝10 mL滅菌凍存離心管中，利用Mobio PowerFecelFecel DNA kit提取糞便DNA。以提取的DNA為模板，利用細菌16S全長27F_（16SF）5'-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3'和1492R_（16S-R）5'-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3'進行PCR擴增，將檢測合格的細菌DNA送至百邁客生物科技有限公司，并采用PacBio測序平臺進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 利用Smrtlink輸出CCS文件，使用lima v1.7.0軟件，通過barcode識別CCS，獲得Raw-CCS序列；采用Cutadapt 1.9.1軟件識別并去除引物，得到Clean-CCS序列；利用Uchime v4.2鑒定得到Effective-CCS。使用Usearch軟件以相似度≥97.0%為標準，將Effective-CCS聚類成操作分類單元OTU（Operational Taxonomic Unit），采用Qilme2計算Alpha多樣性指數(shù)。采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼糧對蛋雞生產(chǎn)性能的影響 高粱組的蛋雞產(chǎn)蛋率和平均蛋重均極顯著（P<0.01）的高于玉米組，其中產(chǎn)蛋率較玉米組增加10.39%，平均蛋重較玉米組平均增加5.20%，表明部分高粱品種加入蛋雞飼糧中，可顯著提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和平均蛋重，是優(yōu)良的可選擇用于代替玉米的蛋雞能量飼料（表1）。

表1 各處理蛋雞生產(chǎn)性能指標

2.2 不同飼糧對蛋雞血液指標的影響 蛋雞飼喂高粱后，其體內(nèi)血清總膽固醇含量較玉米組降低20.22%，血清總甘油三脂含量降低53.18%，血清低密度脂蛋白含量降低17.92%，血清高密度脂蛋白含量降低44.36%，其中血清總甘油三脂和血清高密度脂蛋白含量兩組差異達到顯著水平（P<0.05），表明飼喂高粱可明顯降低蛋雞體內(nèi)血清甘油三酯的含量，對蛋雞機體的脂代謝有一定調(diào)節(jié)作用（表2）。

表2 各處理血清指標mmol/L

2.3 不同飼糧蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)總體差異 本研究共獲得屬于細菌的序列68378條，平均5698條CCS序列；依據(jù)97%的序列相似性鑒定出392個OTUs聚類信息，其中玉米飼糧組315個，高粱飼糧組320個，兩組共有的OTUs數(shù)為243個，玉米組特異的OUTs為72個，高粱組特有的OUTs為77個（圖1）。玉米飼糧組的序列數(shù)高于高粱組，但平均OTU數(shù)少于高粱組，高粱組OTU數(shù)量極顯著高于玉米組（P<0.01）。

圖1 各處理特征Venn圖

2.4 不同飼糧蛋雞腸道菌群多樣性分析 本試驗中12份樣本文庫的覆蓋率 （Coverage）為99.42%～95.11%，表明本次測序結(jié)果可以代表雞糞樣本中微生物的真實情況，UPGMA分析將12份樣本可聚為玉米飼糧組和高粱飼糧組2類，表明兩組樣品間群落組成的差別較大，表明飼喂高粱對蛋雞腸道菌群的影響較明顯（圖2）。Alpha多樣性分析中（圖3），高粱日糧組的ACE、Chao1、Simpson、Shannon指數(shù)均高于玉米飼糧組，其中Chao1、Simpson、Shannon分 別 高 出 玉 米 飼 糧 組77.27%、74.74%和51.27%，且差異水平均達到極顯著（P＜0.01），表明飼糧中添加高粱可以提高蛋雞腸道菌群多樣性。

圖2 UPGMA分析聚類圖

圖3 Alpha多樣性指數(shù)

2.5 不同飼糧蛋雞腸道菌群構(gòu)成分析 各處理細菌門水平上，豐度前十的物種分別為厚壁菌門（Firmicutes），擬桿菌門（Bacteroidetes），變形菌門（Proteobacteria），疣微菌門（Verrucomicrobiota），軟壁菌門（Tenericutes），螺旋菌門（Spirochaetota），Kiritimatiellaeota，埃普西隆桿菌門（Epsilonbacteraeota），梭桿菌門（Fusobacteriota），互養(yǎng)菌門（Synergistota）。玉米組蛋雞腸道第一優(yōu)勢菌為厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度值為81.44%，第二優(yōu)勢菌為擬桿菌門 （Bacteroidetes），相對豐度值為9.64%，第三優(yōu)勢菌為變形菌門（Proteobacteria），相對豐度值為7.62%；高粱組蛋雞腸道第一優(yōu)勢菌為擬桿菌門 （Bacteroidetes），相對豐度值為44.26%，第二優(yōu)勢菌為厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度值為36.67%，第三優(yōu)勢菌為疣微菌門（Verrucomicrobia），相對豐度值為6.32%。其中高粱組的厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度值較玉米組降低44.77%，差異水平極顯著；高粱組的擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）較玉米組分別增加34.62%、6.20%，高粱組的軟 壁 菌 門（Tenericutes）、螺 旋 菌 門（Spirochaetes）和互養(yǎng)菌門（Synergistetes）的相對豐度值較玉米組都有明顯增多。

圖4 樣品門水平物種分布

在細菌屬水平上豐度前十的細菌屬分別是 乳桿菌屬（Lactobacillus），羅姆布茨菌（Romboutsia），擬桿菌屬（Bacteroides），理研菌科RC9腸道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group），擬桿菌屬不可培養(yǎng)菌（uncultured_bacterium_o_Bacteroidales），雞肝菌屬（Gallibacterium），艾克曼菌屬（Akkermansia），考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium），普雷沃式菌屬（Prevotellaceae_UCG-001），扭鏈瘤胃球菌屬（[Ruminococcus]-torques-group）。玉米組第一優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus），相對豐度值為38.30%，第二優(yōu)勢菌屬為羅姆布茨菌（Romboutsia），相對豐度值為29.92%，第三優(yōu)勢菌屬為雞肝菌屬（Gallibacterium），相對豐度值為6.91%。高粱組第一優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬（Bacteroides），相對豐度值為16.39%，第二優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬不可培養(yǎng)菌（uncultured_bacterium_o_Bacteroidales），相對豐度值為9.97%，第三優(yōu)勢菌屬為理研菌科RC9腸道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group），相對豐度值為9.74%。其中高粱組乳桿菌屬（Lactobacillus）、羅姆布茨菌（Romboutsia）的相對豐度較玉米組分別降低28.64%、25.31%。高粱組擬桿菌屬（Bacteroides）、擬桿菌屬不可培養(yǎng)菌（uncultured_bacterium_o_Bacteroidales）、理研菌科RC9腸道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、 艾 克 曼 菌 屬（Akkermansia）和考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）的相對豐度較玉米組分別增加15.32%、9.15%、6.07%、5.85%、4.89%。

圖5 樣品屬水平物種分布

3 討論

日糧中添加高粱可一定程度影響蛋雞生產(chǎn)性能，目前，該方面研究主要針對肉雞的研究較多，鮮見蛋雞方面的報道。Fagundes等（2017）研究表明，利用高粱全部或部分代替玉米飼喂肉雞，對肉雞的采食量、體重和飼料轉(zhuǎn)化率沒有顯著影響。 然而，Silva等（2015）研究結(jié)果證明，飼喂高粱可顯著提高肉雞以上指標，類似的，本研究中高粱組的蛋雞產(chǎn)蛋率和平均蛋重均極顯著（P<0.01）的高于飼喂玉米組?？梢?，高粱的飼喂效果可能受諸多因素影響，其機制需要進一步研究。另外，本研究中高粱飼糧組的血清膽固醇和總甘油三脂含量含量均低于玉米飼糧組，這可能與高粱種皮中所含單寧物質(zhì)有關(guān)，Zheng等（2018）和Masumoto等（2016）研究表明，高粱單寧能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達水平，減輕高脂引起的肥胖，改善血脂水平等。

動物腸道菌群種類的多樣性和豐富性對維持腸道微生態(tài)平衡起著至關(guān)重要的作用（Yu等，2015），腸道微生物群落受諸多因素影響，其中飲食是影響腸道微生物菌落多樣性的主要因素之一。本研究分別用60%的玉米和高粱添加蛋雞濃縮料飼喂蛋雞，基于PacBio測序平臺對不同飼喂組蛋雞糞便菌類16SrDNA進行高通量測序，每處理重復(fù)6次，UPGMA聚類將12份樣本精確地區(qū)分為玉米飼糧和高粱飼糧組，表明每個處理內(nèi)采樣重復(fù)性較好，可有效減小組內(nèi)誤差，提高試驗結(jié)果的可靠性。16SrDNA測序共獲得屬于細菌的序列68378條，鑒定出392個OTUs聚類信息，兩組共有的OTUs數(shù)為243個，其中飼喂高粱組平均OTU數(shù)量極顯著高于玉米組（P<0.01），多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明高粱日糧組的Chao1、Simpson、Shannon指數(shù)都極顯著高于玉米飼糧組（P<0.01），以上結(jié)果均表明飼喂高粱增加了蛋雞腸道微生物多樣性。

腸道菌群構(gòu)成分析表明在門水平玉米飼糧組和高粱飼粱組蛋雞腸道兩大優(yōu)勢菌均是Firmicutes和Bacteroidetes，這與Erinle等（2022）的研究結(jié)果一致，另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群中高Firmicutes/Bacteroidetes（F：B）值與動物肥胖癥、腸道菌群失調(diào)等疾病有重要關(guān)聯(lián)（Magne等，2020；Razavi等，2019），動物飼喂中添加抗生素可顯著提高F：B值（Dudek-Wicher等，2018）。本研究中，飼喂高粱顯著增加了Bacteroidetes菌群豐度，降低了Firmicutes菌群豐度，從而減小了Firmicutes/Bacteroidetes（F：B）值，這可能與高粱籽粒中的多酚類物質(zhì)有關(guān)，體外試驗表明植物多酚類物質(zhì)可顯著降低F：B值（Xue等，2016）。在屬水平上高粱顯著增加了Bacteroides，uncultured_bacterium_of_Bacteroidales，Akkermansia，Phascolarctobacterium的豐度，其中Akkermansia菌屬可改善動物肥胖、炎癥反應(yīng)以及調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答，維持體內(nèi)代謝平衡等作用。

4 結(jié)果

本試驗結(jié)果表明，高粱型日糧可提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和平均蛋重，降低蛋雞體內(nèi)總膽固醇及低密度膽固醇含量，增加蛋雞腸道細菌多樣性，對蛋雞腸道菌群具有一定的正向調(diào)控作用。參與調(diào)節(jié)的物質(zhì)可能與高粱種皮的一些功能成分有關(guān)，該結(jié)論還有待于進一步深入研究。