許思貴，莫懷忠，向梅，王德莉

（1.貴州醫(yī)科大學 麻醉學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 麻醉科，貴州 貴陽 550000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球第二致死性惡性腫瘤[1]。目前，肝癌的臨床治療方案主要包括常規(guī)化療、手術切除、肝移植、射頻消融、經導管動脈化療栓塞等[2]。盡管近年來肝癌的診斷和治療有了較大的進步，但由于肝癌患者術后復發(fā)率和轉移率均較高，其遠期預后和生存率仍然不理想[3]。異丙酚作為癌癥手術最常用的麻醉藥物之一，其可通過下調ERK-VEGF/MMP-9 信號通路抑制直腸癌、食管癌等消化系統(tǒng)腫瘤的進展[4-5]。研究[6]報道，異丙酚還可通過調節(jié)PI3K/Akt通路抑制肝癌細胞的發(fā)生發(fā)展。此外，也有研究[7]報道，異丙酚抑制肝癌細胞的進展過程可能與其調控Wnt/β-catenin 信號通路有關。然而，異丙酚是否還通過其他通路對肝癌細胞的生長和轉移產生影響還有待進一步研究。研究表明，VEGF 和MMP-9 的表達與肝癌細胞血管生成和侵襲能力的關系十分密切[8-9]。故本研究通過檢測ERK-VEGF/MMP-9 信號通路關鍵蛋白的表達，進一步深入探討異丙酚對肝癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響，為異丙酚麻醉下肝癌手術治療的優(yōu)勢提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肝癌HepG2 細胞（上海富衡細胞庫），DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶（北京賽澳美細胞技術有限公司），異丙酚（英國阿斯利康制藥有限公司），二甲基亞砜（DMSO）（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8 溶液（美國Apexbio 公司），胎牛血清（上海吉泰依科賽生物科技有限公司），Transwell 小室、Matrigel 膠（美國康寧公司），Western blotting 所用的一抗、ECL 試劑（江蘇親科生物研究中心有限公司），二抗（美國EarthOx 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

將含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基6 mL 加入培養(yǎng)皿中，然后將人肝癌HepG2 細胞以適當?shù)拿芏冉臃N于皿中，在濕度合適、37℃、5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當單層培養(yǎng)融合超過90%時，通過胰酶適度消化，然后進行細胞傳代培養(yǎng)。將異丙酚溶解于DMSO 中，用不含血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋異丙酚，以不同濃度（0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 和20 μg/mL）異丙酚處理HepG2 細胞48 h，并以相同濃度的DMSO 處理HepG2 細胞作為陰性對照組（DMSO 組），以DMEM 培養(yǎng)基和CCK-8 溶液處理HepG2 細胞作為空白對照組。

1.3 CCK-8 實驗檢測異丙酚處理后的HepG2 細胞活性

將細胞以每孔2×103個/mL 的密度接種于96 孔板中過夜后，用DMSO 及0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL 異丙酚處理48 h 后，首先用純培養(yǎng)基將CCK-8 溶液配成10%的溶液，棄去舊培養(yǎng)基，然后在孔板中加入10% 的CCK-8 溶液，100 μL/孔，避光培養(yǎng)1～2 h，測定細胞在450 nm波長處的光密度（OD）。增殖率（%）=（OD藥物組-OD空白對照組）/（OD陰性對照組-OD空白對照組）×100%。

1.4 劃痕實驗

將細胞接種于6 孔板中，每孔5×105個細胞，培養(yǎng)至細胞單層融合，用200 μL 槍頭尖端沿著直尺垂直于板中央劃一條直線，沿著孔壁加入磷酸鹽緩沖液（PBS），洗滌2 遍，加入相應濃度的異丙酚，培養(yǎng)48 h 后用倒置顯微鏡觀察3 個視野下劃痕面積。在0 h、48 h 采集圖像，使用Image J 軟件計算劃痕面積。細胞遷移率（%）=（初始劃痕面積-48 h劃痕面積）/初始劃痕面積×100%。

1.5 Transwell 侵襲實驗評估HepG2 細胞的侵襲能力

首先將Matrigel 基質稀釋到合適濃度后鋪于小室，置于培養(yǎng)箱保存2 h，待其凝固，將不同濃度的異丙酚處理的HepG2 細胞（2×105個/mL）接種到Transwell 小室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL，在37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，用棉簽蘸去上室內側面貼壁細胞，將侵襲穿過的細胞小室置于24 孔板內，加入4%多聚甲醛，放入37℃培養(yǎng)箱中固定30 min，再將小室置于盛有0.1%結晶紫染液的孔內，放入37℃培養(yǎng)箱中染色20 min，PBS 洗3 遍，顯微鏡下隨機取5 個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.6 Western blotting 檢測MMP-9、VEGF、ERK及p-ERK蛋白相對表達量

HepG2 細胞在裂解前分別用DMSO、0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL 的異丙酚處理48 h。加入RIPA 裂解液，提取總蛋白，BCA 標準蛋白定量化測定蛋白濃度。然后進行SDS-PAGE（10%）凝膠電泳，轉膜，脫脂奶粉（5%，1 h）封閉后，分別將膜與GAPDH（1∶5 000）、MMP-9（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）、ERK（1∶3 000）及p-ERK（1∶1 000）一抗溶液混合均勻，置于4℃冰箱里面的搖床上晃動孵育過夜，TBST 洗膜，用HRP 標記的二抗（1∶20 000）孵育1 h，TBST 洗 膜，使 用ECL 試劑對 條帶顯 影，以GAPDH 為內參，采用Image J 軟件分析條帶。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 異丙酚抑制HepG2細胞增殖

CCK-8 實驗結果顯示，空白對照組、DMSO 組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組細胞增殖率分別為（100.00±3.79）%、（99.70±7.75）%、（84.76±4.24）%、（73.34±4.29）%和（59.80±4.79）%，空白對照組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組和20 μg/mL 組增殖率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=56.096，P=0.000），5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 細胞增殖率較空白對照組降低（P<0.05），且隨著異丙酚濃度升高，HepG2 細胞增殖能力降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。DMSO 組細胞增殖率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度異丙酚對HepG2細胞增殖的影響

2.2 異丙酚抑制HepG2細胞遷移

劃痕實驗結果顯示，空白對照組、DMSO 組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組細胞遷移率分別為（25.43±0.88）%、（24.91±1.72）%、（19.48±1.58）%、（12.57±1.26）%和（6.53±1.32）%，空白對照組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組細胞遷移率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=104.239，P=0.000），5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組細胞遷移率較空白對照組降低（P<0.05），且隨著異丙酚濃度升高，HepG2 細胞遷移率降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。DMSO 組細胞遷移率與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度異丙酚對HepG2細胞遷移的影響（×100）

2.3 異丙酚抑制HepG2細胞侵襲

Transwell 侵襲實驗結果顯示，空白對照組、DMSO 組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組穿膜細胞數(shù)分別為（168.20±13.99）個、（162.40±14.15）個、（134.80±7.29）個、（92.00±11.87）個 和（75.00±6.71）個，空白對照組、5 μg/mL 組、10 μg/mL組、20 μg/mL 組穿膜細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=68.277，P=0.000），5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組穿膜細胞數(shù)較空白對照組減少（P<0.05），且隨著異丙酚濃度升高，HepG2 細胞穿膜細胞數(shù)減少，呈現(xiàn)濃度依賴性。DMSO 組穿膜細胞數(shù)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度異丙酚對HepG2細胞侵襲的影響（×100）

2.4 異丙酚對肝癌細胞中MMP-9、VEGF、p-ERK/ERK蛋白表達的影響

Western blotting 結果顯示，空白對照組、DMSO組、5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組的MMP-9、VEGF、p-ERK/ERK 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），5 μg/mL 組、10 μg/mL 組、20 μg/mL 組的MMP-9、VEGF、p-ERK/ERK 的蛋白相對表達量較空白對照組降低（P<0.05）。而DMSO 組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1 和圖4。

圖4 各組細胞中VEGF、MMP-9、p-ERK/ERK蛋白相對表達量

表1 各組細胞中p-ERK/ERK、VEGF、MMP-9蛋白相對表達量比較（）

表1 各組細胞中p-ERK/ERK、VEGF、MMP-9蛋白相對表達量比較（）

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與5 μg/mL 組比較，P<0.05；③與10 μg/mL組比較，P<0.05。

3 討論

肝癌是一種預后不良的侵襲性疾病，其發(fā)病率和病死率都很高，且發(fā)病率仍然呈上升的趨勢。2020 年的全球新發(fā)病例數(shù)約90.6 萬，死亡病例數(shù)約83 萬[10]。盡管生存率變化趨勢有所改善，但肝癌的預后仍然不理想[11]。異丙酚是目前用于外科手術中最常使用的全身靜脈麻醉藥物之一，在全身麻醉誘導、術中麻醉維持及重癥監(jiān)護室的輔助鎮(zhèn)靜中被大量使用[12]。近年來，異丙酚的非麻醉作用也已被廣泛研究，比如其抗癌作用。

基質金屬蛋白酶（MMPs）是一類細胞外基質降解酶家族，與腫瘤細胞的侵襲關系十分密切，MMP-9 是該家族中最重要的降解酶之一[13]。VEGF是最強的血管活性因子之一，可使腫瘤周圍血管生成增加，最終促進腫瘤進一步惡化[8]。

研究表明，ERK 信號通路不僅參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，而且參與了肝癌細胞凋亡、增殖、細胞因子的表達及MMPs 和VEGF 的產生[14]。相關研究[8-9]顯示，VEGF 和MMP-9 與肝癌的發(fā)生發(fā)展關系十分密切，其表達增加可使肝癌細胞周圍的血管生成增加及侵襲能力增強。因此，下調VEGF、MMP-9 的表達對抑制肝癌的進展變得至關重要。

大量研究集中于異丙酚對腫瘤細胞的影響。在胃癌細胞中，異丙酚通過上調miR-195，可以顯著抑制胃癌細胞的進一步惡化[15]。在肺癌細胞中，異丙酚通過調節(jié)miR-1284 變化從而對肺癌細胞的生長和轉移潛能產生抑制作用[16]。在肝癌細胞中，異丙酚可通過下調miR-374a 從而有效抑制肝癌細胞發(fā)生發(fā)展[17]。本研究通過CCK-8 實驗、Transwell 侵襲實驗及劃痕實驗進一步證明了異丙酚對HepG2 細胞的增殖、侵襲及遷移能力具有抑制作用，與上述研究一致。本研究結果顯示，與空白對照組比較，5 μg/mL 組、10 μg/mL 組及20 μg/mL 組細胞增殖率、遷移率降低，穿膜細胞數(shù)減少，且隨著異丙酚濃度升高，HepG2 細胞增殖率、遷移率降低，穿膜細胞數(shù)減少，呈劑量依賴性。這些結果提示，異丙酚呈劑量依賴性地抑制HepG2 細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

據(jù)報道[5]，異丙酚可通過調控ERK-VEGF/MMP-9 信號通路，對食管癌細胞的活性及轉移潛能具有抑制作用[5]。然而，在肝癌中，是否存在ERKVEGF/MMP-9 這樣一條信號通路，且異丙酚是否可通過調節(jié)該通路抑制肝癌的進展，目前尚不清楚。因此，本研究使用不同濃度的異丙酚處理肝癌細胞，并檢測異丙酚處理細胞后與侵襲、遷移及血管生成相關蛋白質的變化。結果發(fā)現(xiàn)，異丙酚處理的肝癌細胞中VEGF 和MMP-9 蛋白相對表達量降低，表明異丙酚通過下調MMP-9、VEGF 的表達對肝癌細胞的侵襲及遷移潛能具有抑制作用。

研究表明，異丙酚可通過下調ERK 信號通路抑制增殖相關蛋白Cyclin D1 及MMP-9 的表達，從而抑制乳腺癌細胞的進展[18]。另一項研究報道，異丙酚抑制胰腺癌的生長和轉移，可能與下調ERK/MMPs信號通路有關[19]。此外，異丙酚一方面通過抑制腫瘤細胞多種促血管生成因子的表達和分泌。另一方面，異丙酚還通過下調VEGF/VEGFR 通路，產生抗血管生成作用，最終阻止腫瘤進一步惡化，體現(xiàn)了異丙酚的抗癌特性[20]。與上述研究結果一致，本研究結果發(fā)現(xiàn)，異丙酚處理HepG2 細胞48 h 后，細胞中ERK 總蛋白水平無顯著變化，但p-ERK/ERK 表達下調，即ERK 磷酸化水平被異丙酚抑制。同時，經異丙酚處理后，VEGF 和MMP-9 表達水平降低。提示異丙酚可能通過抑制ERK 發(fā)生磷酸化，從而降低VEGF 和MMP-9 的表達。研究發(fā)現(xiàn)，ERK 信號通路的激活可通過上調其下游MMP-9 的表達來增加腫瘤細胞的侵襲和轉移，而抑制該信號通路可以減少腫瘤的侵襲和轉移[21-22]。此外，先前的研究[23]表明，VEGF 的表達上調依賴于ERK 的激活，當ERK 信號通路被激活時，可通過上調VEGF 的表達，從而促進腫瘤血管生成。提示VEGF 是ERK 信號通路的下游。因此，推測丙泊酚可使ERK 信號通路失活，降低ERK 磷酸化水平，從而降低下游靶蛋白VEGF 和MMP-9 的表達，最終抑制肝癌細胞的增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，本研究進一步驗證了異丙酚對肝癌的抗癌活性。異丙酚抑制肝癌細胞株HepG2 的增殖、侵襲及遷移，可能與異丙酚下調ERK-VEGF/MMP-9 信號通路有關。但本研究僅在細胞水平驗證異丙酚對肝癌細胞的影響，異丙酚在動物模型上是否存在同樣的信號通路，有待進一步深入研究。