鄧力強(qiáng)，羅德保

（郴州市第一人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 郴州 423000）

鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽部上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，多發(fā)于中國南部和東南亞國家，男性發(fā)病率是女性的2～3 倍[1-2]。鼻咽癌發(fā)病隱匿，早期癥狀隱蔽，腫瘤惡性程度相對(duì)較高[3]。目前臨床常用的治療方案包含放療、化療、外科手術(shù)等，雖然一系列醫(yī)療措施提升了鼻咽癌患者生存率，但鼻咽癌患者預(yù)后仍不理想，治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移仍是造成鼻咽癌患者死亡的主要原因[4]。

癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移是較為復(fù)雜的生理病理過程，涉及癌細(xì)胞從原發(fā)瘤體脫落向周圍組織浸潤、入侵血管、增殖分化等一系列病理過程。P 物質(zhì)（substance P,SP）是人體內(nèi)的速激肽之一，可與其受體神經(jīng)激肽-1（neurokinin-1 receptor,NK-1R）互相作用而發(fā)揮多種作用[5-6]。目前國內(nèi)外研究[7-9]已證實(shí)SP、NK-1R 與惡性腫瘤有關(guān)，SP、NK-1R 可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移及微血管生成，與乳腺癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的遷移、浸潤關(guān)系密切。本研究擬探討鼻咽癌組織中SP、NK-1R 表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，期望為鼻咽癌的治療提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年4 月—2018 年11 月郴州市第一人民醫(yī)院收治的鼻咽癌患者83 例作為研究組，另選取該院同期行鼻中隔偏曲矯正術(shù)患者47 例為對(duì)照組。其中，研究組男性61 例，女性22 例；年齡（56.23±6.21）歲。對(duì)照組男性27 例，女性20 例；年齡（54.94±6.09）歲。兩組的性別構(gòu)成及年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.533，P=0.060；t=1.146，P=0.254），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究組符合《SEOM 鼻咽癌治療臨床指南2013》[10]的鼻咽癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組經(jīng)病理證實(shí)鼻咽黏膜組織正常；②研究組首次行鼻咽癌根治性治療；③研究組既往未接受任何形式治療；④年齡>18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他部位惡性腫瘤、嚴(yán)重內(nèi)科合并癥；②重要臟器嚴(yán)重功能障礙、血栓高度風(fēng)險(xiǎn)及存在活動(dòng)性出血；③伴有免疫缺陷性疾病、傳染性疾病、血液系統(tǒng)疾??；④存在溝通障礙；⑤存在治療禁忌證及癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；⑥無法完成本研究者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，患者自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 對(duì)照組鼻內(nèi)鏡輔助下行鼻中隔偏曲矯正術(shù)，保留正常鼻咽黏膜組織待檢。參照《SEOM 鼻咽癌治療臨床指南2013》[10]，根據(jù)研究組患者個(gè)體情況給予根治性放療、化療、外科根治治療等，保留鼻咽癌組織待檢。

1.2.2 研究組鼻咽癌組織、對(duì)照組正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R mRNA 相對(duì)表達(dá)量測(cè)定 利用RNA 提取劑RNAiso Plus（日本TaKaRa 公司）提取鼻咽癌組織、正常鼻咽黏膜組織中總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度、純度，篩選后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板行PCR 擴(kuò)增，之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）（美國ABI 7500 Fast Realtime PCR System PCR 儀）。反應(yīng)體系為20 μL：基組DNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、PCR 緩沖液10 μL、蒸餾水8 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性12 s，60℃退火32 s，72℃延伸3 min，共38 個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參基因，以Ct 值為基礎(chǔ)，2-ΔΔCt法計(jì)算鼻咽癌組織、正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)研究組鼻咽癌組織和對(duì)照組正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R 蛋白的表達(dá) 鼻咽癌組織和正常鼻咽黏膜組織標(biāo)本多聚甲醛固定、脫水，石蠟包埋、切片，滅活、微波抗原修復(fù)、洗滌，添加兔抗人SP、NK-1R 抗體，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔二抗后，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗，二氨基聯(lián)苯顯色后，蘇木精復(fù)染、脫水、封片。染色程度為無色（0 分）、淡棕色（1 分）、棕色（2 分）、棕褐色（3 分）；染色范圍<5%為0 分、5%～<25%為1 分、25%～<75%為2 分、≥75%為3 分；計(jì)算染色程度與染色范圍評(píng)分的乘積，0 分者為陰性表達(dá)，否則為陽性表達(dá)。

1.2.4 隨訪 研究組患者治療后以門診復(fù)查、住院治療、電話等方式隨訪3 年，1 次/月。參照《鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移診斷專家共識(shí)》[11]判斷隨訪期間復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況，出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移則終止隨訪。無病生存是指隨訪期間無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況出現(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較做χ2檢驗(yàn)；用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較采用Log rank χ2檢驗(yàn)；影響因素的分析采用多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組SP、NK-1R mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

研究組鼻咽癌組織與對(duì)照組正常鼻咽黏膜組織中的SP、NK-1R mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），鼻咽癌組織中SP、NK-1R mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于正常鼻咽黏膜組織。見圖1 和表2。

表2 兩組SP、NK-1R mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

表2 兩組SP、NK-1R mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

圖1 研究組鼻咽癌組織與對(duì)照組正常鼻咽黏膜組織中的SP、NK-1R mRNA表達(dá)

2.2 研究組鼻咽癌組織和對(duì)照組正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R蛋白的表達(dá)

研究組鼻咽癌組織和對(duì)照組正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R 蛋白的表達(dá)見圖2。研究組鼻咽癌組織與對(duì)照組正常鼻咽黏膜組織中的SP、NK-1R 蛋白陽性表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），鼻咽癌組織中SP、NK-1R 蛋白陽性表達(dá)率高于正常鼻咽黏膜組織。見表3。

圖2 研究組鼻咽癌組織和對(duì)照組正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R蛋白的表達(dá)（IHC×200）

表3 鼻咽癌組織和正常鼻咽黏膜組織中SP、NK-1R蛋白陽性表達(dá)率的比較 例（%）

2.3 研究組不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織中SP、NK-1R蛋白陽性表達(dá)率的比較

不同性別、年齡、N 分期的研究組患者鼻咽癌組織中SP、NK-1R 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。不同T 分期、M 分期、臨床分期的研究組患者鼻咽癌組織中SP 陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；研究組T3、T4期患者的鼻咽癌組織中SP 陽性表達(dá)率高于T1、T2期患者，研究組M1期患者的鼻咽癌組織中SP 陽性表達(dá)率高于M0期患者，Ⅲ～Ⅳa 期的研究組患者鼻咽癌組織中SP 陽性表達(dá)率分別高于Ⅰ、Ⅱ期患者。不同M 分期、臨床分期的研究組患者鼻咽癌組織中NK-1R 陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；研究組M1期患者的鼻咽癌組織中NK-1R 陽性表達(dá)率高于M0期患者，研究組Ⅲ～Ⅳa 期患者的鼻咽癌組織中NK-1R 陽性表達(dá)率分別高于Ⅰ、Ⅱ期患者。見表4。

表4 研究組不同臨床病理特征患者鼻咽癌組織中SP、NK-1R蛋白陽性表達(dá)率的比較 例（%）

2.4 影響鼻咽癌患者治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的因素

83 例鼻咽癌患者截至隨訪結(jié)束時(shí)失訪8 例（7 例為SP 蛋白陽性表達(dá)，1 例為SP 陰性表達(dá)；8 例均為NK-1R 蛋白陽性表達(dá)）。75 例鼻咽癌患者中10 例（13.33%）出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。

單因素分析顯示，T 分期、M 分期、臨床分期、SP陽性、NK-1R 陽性是影響鼻咽癌患者治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的因素（P<0.05）。見表5。

表5 影響鼻咽癌患者治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的單因素分析

以鼻咽癌患者治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移為因變量（未復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移=0，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移=1），以T 分期（T1、T2=0，T3、T4=1）、M 分期（M0=0，M1=1）、臨床分期（Ⅰ、Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳa=1）、SP 陽性（SP 陰性=0，SP 陽性=1）、NK-1R陽性（NK-1R陰性=0，NK-1R陽性=1）為自變量，納入多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型，α入=0.05、α出=0.10，結(jié)果顯示：M 分 期[R^R=4.958（95% CI：2.040，12.050）]、臨床分 期[R^R=6.593（95% CI：2.713，16.023）]、SP 陽性[R^R=4.063（95% CI：1.672，9.875）]、NK-1R 陽 性[R^R=4.047（95% CI：1.665，9.836）]是影響鼻咽癌患者治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見表6。

表6 影響鼻咽癌患者治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的Cox多因素分析

2.5 研究組患者鼻咽癌組織中SP、NK-1R蛋白表達(dá)與治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

隨訪3 年，43 例SP 陽性表達(dá)患者無病生存34 例，生存率為80.64%；32 例SP 陰性表達(dá)患者無病生存31 例，生存率為96.87%；SP 陰性表達(dá)與陽性表達(dá)患者的生存率比較，經(jīng)Log rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.453，P=0.035），SP 陰性表達(dá)患者的生存率高于陽性表達(dá)患者。見圖3。

圖3 鼻咽癌組織中SP陰性、陽性表達(dá)患者的生存曲線圖

隨訪3 年，38 例NK-1R 陽性表達(dá)患者無病生存29 例，生存率為78.21%；37 例NK-1R 陰性表達(dá)患者無病生存36 例，生存率為97.32%；NK-1R 陽性表達(dá)患者與陰性表達(dá)患者的生存率比較，經(jīng)Log rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.451，P=0.011），NK-1R 陰性表達(dá)患者的生存率高于陽性表達(dá)患者。見圖4。

圖4 鼻咽癌組織中NK-1R陰性、陽性表達(dá)患者的生存曲線圖

3 討論

鼻咽癌屬于頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)生可能與愛潑斯坦-巴爾病毒感染、遺傳、生活環(huán)境等多種因素相關(guān)[12]。目前國內(nèi)外已有報(bào)道指出SP、NK-1R 在乳腺癌[7]、甲狀腺癌[8]等多種癌癥中異常高表達(dá)。但是目前關(guān)于鼻咽癌組織中SP、NK-1R表達(dá)特征尚缺乏報(bào)道，鼻咽癌組織中SP、NK-1R的表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系仍缺乏數(shù)據(jù)支持。

本研究顯示鼻咽癌組織中SP、NK-1R mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常鼻咽黏膜組織，鼻咽癌組織中SP、NK-1R 蛋白陽性表達(dá)率均高于正常鼻咽黏膜組織，說明SP、NK-1R 在鼻咽癌患者癌組織中異常高表達(dá)。M1期、Ⅲ～Ⅳa 期的鼻咽癌患者癌組織中SP、NK-1 蛋白陽性表達(dá)率分別高于M0期、Ⅰ、Ⅱ期者，T3、T4期的鼻咽癌患者癌組織中SP陽性表達(dá)率高于T1、T2期者，提示SP、NK-1R 不僅與鼻咽癌發(fā)生有關(guān)，且與鼻咽癌患者病情相關(guān)的病理特征也有關(guān)，SP、NK-1R 可能與鼻咽癌患者預(yù)后關(guān)系密切。Cox 回歸分析顯示M 分期、臨床分期、SP 陽性、NK-1R 陽性是影響鼻咽癌患者治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，說明并印證鼻咽癌患者癌組織中SP、NK-1R 的表達(dá)是影響鼻咽癌患者預(yù)后的因素。SP 作為一種速激肽，可與其受體NK-1R 互相作用發(fā)揮多途徑生物學(xué)功效，SP 與NK-1R 系統(tǒng)能夠偶聯(lián)激活磷脂酶C 及腺苷酸環(huán)化酶，合成肌醇三磷酸、二酰甘油、環(huán)腺苷磷酸，參與離子通道活性，傳導(dǎo)信號(hào)至絲裂原活化蛋白激酶，蛋白激酶激活細(xì)胞外的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2，進(jìn)而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞有絲分裂、合成DNA，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移。GONZáLEZ-MOLES 等[13]研究指出SP、NK-1R 系統(tǒng)可啟動(dòng)、激活惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生理病理過程的信號(hào)通路。SINGH 等[14]研究顯示SP 與NK-1R系統(tǒng)可促使抗凋亡因子Akt 信號(hào)激活，從而抑制Fas 配體等凋亡因子對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。張渝等[15]研究指出SP 可誘導(dǎo)鼻咽癌HNE1 細(xì)胞增殖、侵襲。

本研究顯示，SP 陰性表達(dá)的鼻咽癌患者的生存率高于SP 陽性表達(dá)者，NK-1R 陰性表達(dá)的鼻咽癌患者的生存率也高于NK-1R 陽性表達(dá)者，再次印證鼻咽癌患者癌組織SP 及NK-1R 表達(dá)與其預(yù)后有關(guān)。既往研究也指出SP 及NK-1R 在其他惡性腫瘤中的相似作用，JAVID 等[16]報(bào)道SP、NK-1R 陽性表達(dá)的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的生存期明顯短于SP、NK-1R 陰性表達(dá)者；AFSHARI 等[17]研究顯示SP、NK-1R 陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)更高；周云麗等[18]研究指出SP、NK-1R 表達(dá)上調(diào)與乳腺癌患者癌細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與乳腺癌患者預(yù)后不良關(guān)系緊密。

綜上所述，鼻咽癌患者癌組織中SP、NK-1R表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)，SP、NK-1R 陽性表達(dá)患者治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高。本研究樣本量較小，隨訪時(shí)間有限，后期將針對(duì)不足之處開展多心中、大樣本量研究，并延長隨訪時(shí)間進(jìn)一步佐證本研究結(jié)論，并著重分析SP、NK-1R 通路對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、分化、遷移的影響，更深入了解SP、NK-1R 在鼻咽癌中的作用機(jī)制。