李艷光，宋翔，牛潔婷，唐國(guó)杰

（滄州市中心醫(yī)院 胸外科，河北 滄州 061000）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma,NSCLC）在原發(fā)性肺癌中最常見(jiàn)，發(fā)生率約為80%～85%，其中75%左右的患者確診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后較差[1]。手術(shù)是目前治療肺癌的主要方式，早期診斷、準(zhǔn)確分期是保障療效的前提。臨床至今尚缺乏檢測(cè)NSCLC 敏感性較高的指標(biāo)，比較常見(jiàn)的包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片 段抗原21-1（cytokeratin 19 fragment antigen 21-1,CYFRA21-1）、鱗狀細(xì)胞癌抗原（sguamous cell carcinoma antigen,SCC-Ag）、糖類(lèi)抗原125（carbohydrate antigen 125,CA125）等腫瘤標(biāo)志物[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，機(jī)體T 淋巴細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答是控制腫瘤生長(zhǎng)、殺滅腫瘤細(xì)胞的重要途徑。γ 干擾素（Interferon γ,IFN-γ）是由CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群Th1 分泌，能激活效應(yīng)細(xì)胞，提高自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell,NK cell）、巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞等活性，通過(guò)免疫機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞[3]。現(xiàn)代免疫學(xué)研究提出，機(jī)體處于應(yīng)激或感染狀態(tài)下，體內(nèi)一些細(xì)胞受體可產(chǎn)生相關(guān)的分子調(diào)節(jié)免疫功能[4]。NK細(xì)胞活化性受體（NKG2D）是對(duì)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)最有效的受體之一，廣泛表達(dá)于NK 細(xì)胞、γ 細(xì)胞中。有研究指出，NKG2D 可通過(guò)免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，從而影響機(jī)體免疫狀態(tài)[5]。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)NKG2D、IFN-γ 與NSCLC 相關(guān)性的研究不多。本研究探討血清NKG2D、IFN-γ水平與NSCLC 患者病情程度、預(yù)后的相關(guān)性，旨在尋找更有效、準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究屬于前瞻性研究，且獲得滄州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。選取滄州市中心醫(yī) 院2020 年5 月—2021 年5 月收治 的NSCLC 患者150 例為研究對(duì)象，根據(jù)TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ、Ⅱ期組50 例，Ⅲ、Ⅳ期組100 例。Ⅰ、Ⅱ期組男性34 例，女性16 例；年齡39～70 歲，平均（54.69±7.94）歲；病理類(lèi)型：鱗狀細(xì)胞癌13 例，腺癌21 例，腺鱗癌16 例。Ⅲ、Ⅳ期組男性71 例，女性29 例；年齡38～72 歲，平均（54.87±8.12）歲；病理類(lèi)型：鱗狀細(xì)胞癌27 例，腺癌43 例，腺鱗癌30 例。兩組患者臨床資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南（2018 版）》[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并有明確的病理結(jié)果；均為原發(fā)性肺癌；年齡>18 歲；在初次治療前有血清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果；造血功能正常；患者對(duì)本研究知情同意并自愿簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：造血功能異常；心肝腎臟器功能不正常；有嚴(yán)重感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾??；有化療或靶向治療史。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 FACSC Calibur 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），Centrifuge 5430 高速冷凍離心機(jī)、微量移液器（德國(guó)Eppendorf 公司），海爾DW-86L288 型（上海領(lǐng)德儀器有限公司），UniCel DxI 800 Access 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。鼠免疫球蛋白（Immunoglobulin G，lgG）、鼠抗人抗NKG2D PERCP-CY5.5 抗體、鼠抗人CD3-FITC、鼠抗人CD8-PE-CY7、鼠抗人CD56-PE、細(xì)胞因子刺激劑、細(xì)胞固定破膜劑（美國(guó)CST 生物科技有限公司），96 孔酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）板（美國(guó)R&D公司），F(xiàn)icoll 淋巴細(xì)胞分離液（北京Solarbio 化學(xué)試劑公司），ELISA 試劑盒（武漢中美科技公司）。

1.2.2 標(biāo)本采集 取患者入院時(shí)的外周靜脈血4 mL，3 000 r/min 離心15 min，取上清液分裝于1.5 mL 的EP 管中，置入-80℃冰箱冷凍保存待測(cè)。

1.2.3 NKG2D檢測(cè) 取樣本加入等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻移至15 mL 離心管中，加入等體積的Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液；20℃、2 400 r/min 離心30 min，輕吸單個(gè)核細(xì)胞層，PBS 液100 r/min 離心10 min，洗滌2 次，棄上清液；用適量PBS 液重懸細(xì)胞，混勻注入新離心（EP）管；加入小鼠IgG 10 μg/mL，40℃孵育30 min，排除假陽(yáng)性；分別加入20 μL 的NKG2D PERCY-CY5.5 抗 體、CD3-FITC、CD56-PE，4℃避光反應(yīng)30 min，1 000 r/min 離心10 min，棄上清液，PBS 液洗滌2 次，移至流式管；加入4% 0.5 mL 多聚甲醛，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)488 nm 波長(zhǎng)處NKG2D水平。

1.2.4 IFN-γ 水平檢測(cè) 取樣本EDTA 抗凝處理，混勻，分裝于2 個(gè)流式管中，加入30 μL 的外周血、2 μL 的細(xì)胞因子刺激劑、1 mL 1640 培養(yǎng)基，混勻，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h；1 500 r/min離心3～5 min，棄上清液；加入100 μL 的1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；加入適量CD3-FITC、CD8-PE-CY7，4℃避光孵育30 min；再加入500 μL 的1640 培養(yǎng)基，洗滌2 次，1 500 r/min 離心3～5min，棄上清液；加入100 μL 的1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再加入細(xì)胞固定破膜劑，4℃20 min；加入500 μL 的1×perm/wash buffer 洗滌，1 500 r/min 離心3～5 min，重復(fù)2 次，棄上清液；加入500 μL 的1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)IFN-γ 水平。

1.2.5 腫瘤標(biāo)志物水平檢測(cè) 采用UniCel DxI 800 Access 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)CEA、CA125、CYFRA21-1 水平。

1.2.6 預(yù)后情況 采用門(mén)診復(fù)查、電話隨訪等方式，記錄患者6 個(gè)月內(nèi)的病死率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；繪制ROC 曲線；相關(guān)性分析用Pearson 法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清NKG2D、IFN-γ比較

兩組患者血清NKG2D、IFN-γ 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅲ、Ⅳ期組NKG2D 低于Ⅰ、Ⅱ期組，IFN-γ 水平高于Ⅰ、Ⅱ期組。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者血清NKG2D、IFN-γ比較（）

表1 兩組患者血清NKG2D、IFN-γ比較（）

2.2 兩組患者的腫瘤標(biāo)志物水平比較

兩組患者的血清CEA、CA125、CYFRA21-1 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅲ、Ⅳ期組CEA、CA125、CYFRA21-1 高于Ⅰ、Ⅱ期組。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物水平比較（）

表2 兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物水平比較（）

2.3 NSCLC患者血清NKG2D、IFN-γ與腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析顯示，血清NKG2D 與CEA（r=-0.683）、CA125（r=-0.615）、CYFRA21-1（r=-0.704）均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）；IFN-γ 與CEA（r=0.512）、CA125（r=0.439）、CYFRA21-1（r=0.543）均呈正相關(guān)（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 NSCLC患者血清NKG2D、IFN-γ與腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

2.4 不同預(yù)后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比較

150 例NSCLC 患者總病死率為22.67%（34/150）。Ⅲ、Ⅳ期組6 個(gè)月內(nèi)病死率為28.00%（28/100），Ⅰ、Ⅱ期組6 個(gè)月內(nèi)病死率為12.00%（6/50），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.868，P=0.027）。死亡組與非死亡組血清NKG2D、IFN-γ 比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），死亡組NKG2D 低于非死亡組，IFN-γ 高于非死亡組。見(jiàn)表4。

表4 不同預(yù)后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比較（）

表4 不同預(yù)后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比較（）

2.5 血清NKG2D、IFN-γ及兩者聯(lián)合對(duì)NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)效能

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，IFN-γ、NKG2D 及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)NSCLC 患者預(yù)后的AUC 分別為0.807（95% CI：0.673，0.942）、0.815（95%CI：0.675，0.955）、0.872（95% CI：0.761，0.984），敏感性分別為78.1%（95% CI：0.648，0.892）、82.6%（95% CI：0.713，0.955）、86.5%（95% CI：0.752，0.978），特異性 為51.3%（95% CI：0.443，0.714）、53.6%（95% CI：0.467，0.735）、41.5%（95% CI：0.328，0.616）。見(jiàn) 圖1和表5。

圖1 血清NKG2D、IFN-γ及兩者聯(lián)合對(duì)NSCLC患者預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線圖

表5 血清NKG2D、IFN-γ及兩者聯(lián)合對(duì)NSCLC患者預(yù)后預(yù)測(cè)的效能分析

3 討論

腫瘤細(xì)胞是一群生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制失常且可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的自身細(xì)胞[7]。T 淋巴細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答、抑制腫瘤生長(zhǎng)的重要免疫細(xì)胞，根據(jù)T 細(xì)胞受體類(lèi)型和表面標(biāo)志可分為CD4+和CD8+兩個(gè)亞群。CD4+T 細(xì)胞主要是通過(guò)激活并釋放效應(yīng)細(xì)胞，增強(qiáng)清除腫瘤細(xì)胞的能力，在抗原特異性免疫過(guò)程中，CD4+T 細(xì)胞釋放的IFN-γ 作用于腫瘤細(xì)胞，可誘導(dǎo)多種抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)MHC-I 類(lèi)分子，提高靶細(xì)胞對(duì)CD8+T 細(xì)胞的敏感性，同時(shí)還能刺激B 細(xì)胞增殖、產(chǎn)生抗體，通過(guò)體液免疫途徑抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)制[8]。CD4+T 細(xì)胞亞群按照分泌的細(xì)胞因子與介導(dǎo)的功能不同又分為T(mén)h1 和Th2 細(xì)胞。Th1 主要分泌IFN-γ、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-β（TNF-β），Th2 主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，分別具有介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫的作用[9]。NSCLC 表面表達(dá)的腫瘤抗原被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別后，可通過(guò)以上免疫機(jī)制產(chǎn)生免疫應(yīng)答，攻擊并抑制腫瘤生長(zhǎng)[10]。

既往國(guó)內(nèi)外研究關(guān)于IFN-γ 的研究較多，NK 細(xì)胞、NKT 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等均有產(chǎn)生IFN-γ 的能力，此效應(yīng)細(xì)胞能夠激活多條信號(hào)途徑，其中被廣泛認(rèn)知的有JAK-STAT 途徑[11]。PAN 等[12]研究顯示，IFN-γ-JAK-STAT 信號(hào)通路可促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。不過(guò)IFN-γ 在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)方面還具有一定爭(zhēng)議性。KANAI 等[13]研究指出，非進(jìn)展期NSCLC 的IFN-γ 水平顯著高于進(jìn)展期NSCLC。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ、Ⅳ期組IFN-γ 水平高于Ⅰ、Ⅱ期組，提示血清IFN-γ 水平與NSCLC 患者的分期與病情有關(guān)。其原因可能為：①I(mǎi)FN-γ 可通過(guò)激活并增強(qiáng)NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞等活力，從而調(diào)節(jié)免疫，增強(qiáng)抗腫瘤能力[14]；②IFN-γ 可抑制癌基因表達(dá)，延緩腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程；③IFN-γ 可增強(qiáng)TNF 的分泌、加強(qiáng)MHC-II 類(lèi)抗原的表達(dá)、上調(diào)TNF 受體進(jìn)而促進(jìn)殺傷性T 細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞[15]；④IFN-γ 還可通過(guò)負(fù)性調(diào)控腫瘤相關(guān)纖維細(xì)胞功能，如纖維細(xì)胞中的SMAD 信號(hào)通路，抑制成纖維細(xì)胞牽拉腫瘤細(xì)胞群而導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。

NKG2D 最早被發(fā)現(xiàn)是NK 細(xì)胞表面主要的激活性受體，隨后不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，NKG2D 還廣泛表達(dá)于γ、δ、T 細(xì)胞等絕大多數(shù)免疫細(xì)胞上，在天然免疫中發(fā)揮著重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ、Ⅳ期組NKG2D 低于Ⅰ、Ⅱ期組，NKG2D 異常降低與NSCLC 患者病情有關(guān)。張靖悅等[18]研究指出，Ⅲ、Ⅳ期NSCLC 患者NKG2D 明顯低于Ⅰ、Ⅱ期患者，與本研究結(jié)論相似。分析原因?yàn)椋孩貼KG2D 可通過(guò)固有性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，進(jìn)以影響機(jī)體的免疫功能[19]；②NKG2D 可通過(guò)與應(yīng)激細(xì)胞表面的配體結(jié)合，傳遞細(xì)胞活化信號(hào)，激活效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮殺害腫瘤細(xì)胞的作用[20]；③NKG2D 可與許多配體結(jié)合，如NK 細(xì)胞與其配體MIC-A 結(jié)合，可刺激前者表達(dá)NKG2D，發(fā)揮對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視作用[21]；④NKG2D與配體MIC 可同時(shí)刺激CD3+CD4+與CD3+CD8+NKG2 D 細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)免疫。

CEA、CA125、CYFRA21-1 是臨床比較常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物，通常用于評(píng)估腫瘤的療效及預(yù)后判斷中。Pearson 相關(guān)性顯示，以上3 項(xiàng)指標(biāo)與NKG2D 呈負(fù)相關(guān)，與IFN-γ 呈正相關(guān)，兩者對(duì)評(píng)估NSCLC 患者病情程度具有一定價(jià)值。LEE 等[22]研究指出，NSCLC 患者血清IFN-γ 水平較高，可有效預(yù)測(cè)NSCLC 的無(wú)進(jìn)展生存期。OKITA 等[23]研究顯示，NKG2D 配體表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)NSCLC 患者的臨床病理學(xué)特征和預(yù)后。本研究ROC 曲線顯示，IFN-γ、NKG2D 及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)NSCLC 患者預(yù)后的AUC 分別為0.807、0.815 和0.872，具有較高預(yù)測(cè)效能。由此可見(jiàn)，檢測(cè)NKG2D、IFN-γ 能夠更好地了解NSCLC的發(fā)生發(fā)展，為預(yù)后提供參考依據(jù)。

綜上所述，血清NKG2D、IFN-γ 與NSCLC 患者病情程度與腫瘤標(biāo)志物水平有關(guān)，且兩者聯(lián)合檢測(cè)可有效預(yù)測(cè)患者早期預(yù)后。