張 婷 王萬倫 劉桐佳 劉 爽 邊艷超 張傳領(lǐng) 肖 瑞

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110

生殖細(xì)胞發(fā)育異常會(huì)導(dǎo)致男性不育[1]。哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生包括精原細(xì)胞的增殖、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂及精子的形成等過程，任何一個(gè)階段發(fā)生異常均會(huì)影響成熟精子的產(chǎn)生[2-3]。

細(xì)胞羧肽酶1（Cytosolic carboxypeptidase 1,CCP1），由Agtpbp1 基因編碼形成，在腦、睪丸及心臟中呈高表達(dá)[4-5]。CCP1 具有去谷氨?；富钚訹6-7]，參與調(diào)控微管的組裝、運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[8-10]。Agtpbp1 基因缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠浦肯野細(xì)胞的變性[11-12]、精子發(fā)生缺陷等[13-17]。微管是細(xì)胞分裂和遷移的重要組成部分，α和β 微管蛋白的多聚谷氨酸化改變與細(xì)胞的增殖分裂密切相關(guān)[18-19]。在肺癌A549 細(xì)胞中敲低AGTPBP1后，該細(xì)胞的增殖與遷移均增加[20]，但CCP1 在睪丸等其他高表達(dá)組織中是否也影響細(xì)胞的增殖尚未有報(bào)道。

本研究利用小鼠初級(jí)精母細(xì)胞GC-2 作為體外細(xì)胞模型，研究CCP1 過表達(dá)對(duì)GC-2 細(xì)胞增殖與周期的影響，并為CCP1 在精子發(fā)生中發(fā)揮作用的分子機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 小鼠精母細(xì)胞（GC-2）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要材料與試劑 MEM NEAA、高糖DMEM（美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)：11140050、C11995500BT）；慢病毒顆粒（中國(guó)上海吉?jiǎng)P基因公司，貨號(hào)：LVCON335）；CCK-8 試劑盒（中國(guó)上海生工公司，貨號(hào)：E606335）；總RNA 提取試劑盒（中國(guó)北京天根公司，貨號(hào)：DP419）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與q-PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司，貨號(hào)：RR047A、RR820A）；兔抗鼠CCP1、兔抗鼠CDK2、兔抗鼠GAPDH 中國(guó)武漢三鷹公司，貨號(hào)：14067-1-AP、10122-1-AP、60004-1-Ig）；紅外熒光染料標(biāo)記的羊抗兔IgG（美國(guó)LICOR 公司，貨號(hào)：RK-611-130-002）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)GC-2 細(xì)胞接種于10%胎牛血清、1%鏈霉素/青霉素及1%MEM NEAA 的高糖DMEM 培養(yǎng)基37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.2 模型制備方法與分組 陰性對(duì)照組（NC 組，感染攜帶空載體慢病毒）；GC-2 細(xì)胞過表達(dá)CCP1 組（GC-2+CCP1 組，感染攜帶CCP1 重組質(zhì)粒慢病毒）。感染6 h 撤去病毒37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 不同時(shí)間每組細(xì)胞各接種5 個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)6、12、24、48、72 h 后，加入CCK-8溶液孵育2 h 后使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm 波長(zhǎng)處的光密度（OD）值并繪制折線圖。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 收集兩組細(xì)胞各3 管，70%乙醇固定過夜，次日收集細(xì)胞沉淀并加入PI 溶液重懸細(xì)胞，37℃避光孵育30 min 后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期并計(jì)算G1期、S 期、G2/M 期細(xì)胞的百分比。

1.2.5 RNA 提取和q-PCR 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到濃度為100 ng/μl 的cDNA。按照總體積20 μl 的反應(yīng)體系（TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2 倍）10 μl，正反向引物各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50 倍）0.4 μl，cDNA 2 μl，滅菌水6 μl），進(jìn)行95℃30 s；95℃3 s，60℃30 s，40 個(gè)循環(huán)的q-PCR反應(yīng)。PCR 引物序列包括Gapdh 正向引物：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向引物：5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’；Ccp1 正向引物：5’-GGGGTCGAAGAGCGAGTTTC-3’，反向引物：5’-GAATGGAGTGAGTCTGCACCA-3’；細(xì)胞周期蛋白B1（Cyclin B1，Ccnb1）正向引物：5’-AAGGTGC-CTGTGTGTGAACC-3’，反向引物：5’-GTCAGCCCCATCATCTGCG-3’；細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1，Ccnd1）正向引物：5’-GCGTACCCTGACACCAATCTC-3’，反向引物：5’-CTCCTCTTCGCACTTCTGCTC-3’;細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，Cdk2）正向引物：5’-CCTGCTTATCAATGCAGAGGG-3’，反向引物：5’-TGCGGGTCACCATTTCAGC-3’。q-PCR 結(jié)果通過2-△△Ct方法統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 Western blot 提取細(xì)胞總蛋白，95℃8 min后進(jìn)行SDS-PAGE 膠；電泳70 V 1 h，110 V 1 h；200 mA轉(zhuǎn)膜1 h；室溫封閉1 h；一抗（CCP1 1∶1 000、CDK2 1∶1 000、GAPDH 1∶10 000）室溫孵育2 h；室溫孵育二抗1 h。在避光條件下將NC 膜置于Odessey CLX 紅外激光成像系統(tǒng)掃描并觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建CCP1 過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系

NC 組與GC-2+CCP1 組細(xì)胞在感染24 h 后均觀察到gcGFP 綠色熒光蛋白的表達(dá)，提示獲得了GC-2+CCP1 細(xì)胞株。見圖1。

圖1 GC-2 細(xì)胞過表達(dá)CCP1

2.2 兩組CCP1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平比較

與NC 組比較，GC-2+CCP1 組CCP1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均升高（t=79.55，P ＜0.000 1）。見圖2。

圖2 兩組CCP1 mRNA 和蛋白表達(dá)情況

2.3 CCP1 過表達(dá)抑制GC-2 細(xì)胞的增殖

與NC 組比較，GC-2+CCP1 組細(xì)胞在培養(yǎng)72 h后增殖能力降低（t=3.132，P=0.035）。見圖3。

圖3 CCP1 過表達(dá)對(duì)GC-2 細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 CCP1 過表達(dá)導(dǎo)致GC-2 細(xì)胞發(fā)生G2/M 期阻滯

與NC 組比較，GC-2+CCP1 組細(xì)胞周期G1期降低，G2/M 期增高（P ＜0.05），兩組S 期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）（表1、圖4A～B），Ccnb1 與Ccnd1 的mRNA 表達(dá)水平降低（P=0.010、0.006）（圖4C），而Cdk2 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平均升高（P=0.003）（圖4C～D）。

圖4 CCP1 過表達(dá)對(duì)GC-2 細(xì)胞周期及細(xì)胞周期蛋白的影響

表1 兩組細(xì)胞周期分布比較（%，）

表1 兩組細(xì)胞周期分布比較（%，）

3 討論

精子發(fā)生過程包括連續(xù)的細(xì)胞周期增殖、有絲分裂、減數(shù)分裂和分化，對(duì)產(chǎn)生精子很重要[21]。在CCP1缺失的pcd 小鼠中不僅出現(xiàn)神經(jīng)退行性病變，還表現(xiàn)出精子發(fā)生缺陷[15-17]。

本研究選擇GC-2 細(xì)胞作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)CCP1過表達(dá)會(huì)抑制GC-2 細(xì)胞的體外增殖能力發(fā)生G2/M期阻滯。CCP1 的過表達(dá)抑制生殖細(xì)胞GC-2 的增殖，則會(huì)影響小鼠睪丸的生殖和發(fā)育及正常精子的產(chǎn)生，但這還需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

Cdk2、Ccnb1 及Ccnd1 是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子，三者的異常表達(dá)均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期與增殖發(fā)生異常[22-25]。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)過表達(dá)CCP1 時(shí)GC-2 細(xì)胞的Cdk2、Ccnb1 及Ccnd1 的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，這一現(xiàn)象可能是CCP1 過表達(dá)抑制GC-2 細(xì)胞體外增殖能力的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控CCP1 過表達(dá)可能通過調(diào)控Cdk2、Ccnb1 及Ccnd1 的表達(dá)抑制GC-2 細(xì)胞的增殖發(fā)生G2/M 期阻滯。因此，CCP1 在睪丸生殖細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮著重要作用，但確切的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。