代欣 曹博然 李丹 袁雅琴 李斌

肝癌是全球第六大原發(fā)性癌癥，也是世界癌癥相關死亡的第四大原因。乙型肝炎病毒(HBV)的高感染率以及黃曲霉素的高暴露更加大了我國肝癌的發(fā)生率。肝細胞癌(HCC)約占肝癌的90%，主要由HBV或丙型肝炎病毒(HCV)感染、酗酒或代謝綜合征引起的慢性肝病背景下發(fā)展而來[1]。其5年生存率約為18%。同時由于其發(fā)病隱匿，80%以上的患者確診時已為中晚期，致使HCC成為重大的醫(yī)療負擔。

既往肝癌的治療是以手術治療為主的綜合治療模式，其中包括射頻消融、介入治療、靶向治療、化療、放療等，同時也包括針對于乙型肝炎等基礎疾病的治療，如抗病毒治療、保肝利膽及對癥支持治療等。50%～60% 的 HCC 患者最終將接受系統(tǒng)性治療，傳統(tǒng)的一線治療主要是索拉非尼、樂伐替尼及我國自主研發(fā)的多納非尼，二線治療主要是是瑞戈非尼、卡博替尼、雷莫蘆單抗及我國自主研發(fā)的阿帕替尼。自2017年以來，免疫檢查點抑制劑包括靶向PD-1/PD-L1和CTLA-4的單克隆抗體逐漸被FDA批準應用于晚期HCC的二線治療，隨后免疫檢查點抑制劑聯(lián)合抗血管生成治療被證實相較于傳統(tǒng)一線治療可改善患者生存，并被批準應用為晚期HCC患者的一線治療藥物。盡管免疫治療在肝癌治療中取得了重大進展，但僅有20%～30%的患者對免疫治療有效。這表明HCC腫瘤微環(huán)境(TME)通過復雜的機制導致了免疫檢查點抑制劑的耐藥。闡明其耐藥機制對于重塑免疫微環(huán)境以及提高療效具有重要意義。

一、 肝臟免疫耐受微環(huán)境

肝臟作為一類“免疫豁免”器官，其免疫微環(huán)境具有其獨特的特點。由于其不斷暴露于來自環(huán)境和飲食的抗原以及來自腸道微生物群的微生物產(chǎn)物，肝臟必須維持高度耐受的免疫環(huán)境，具有嚴格的免疫調節(jié)過程。其中，非實質肝細胞(如庫普弗細胞、肝星狀細胞和肝竇內皮細胞、樹突狀細胞)在維持免疫耐受方面發(fā)揮了重要作用。與來自其他器官的樹突狀細胞相比，基礎條件下的肝臟樹突狀細胞已被證明具有降低 T 細胞活化的能力[2]。這些特點雖然在機體維穩(wěn)中起到重要作用，但同時也能夠促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在腫瘤中，非實質肝細胞能夠與腫瘤細胞、腫瘤相關成纖維細胞協(xié)同促使免疫逃逸。HCC免疫微環(huán)境伴隨著上調的循環(huán)和腫瘤內淋巴細胞 PD-1/PD-L1的表達[3]，為HCC免疫治療提供了背景，克服免疫治療耐藥成為了提升療效的重要突破點。

二、免疫治療耐藥機制

(一) 原發(fā)性耐藥

1.缺乏新抗原生成和抗原呈遞缺陷：腫瘤新抗原是指腫瘤細胞基于基因組突

變而產(chǎn)生的異常多肽。作為腫瘤特異性抗原，新抗原相比較腫瘤相關抗原更具有免疫原性，并且不會誘導自身免疫[4]。具有較高腫瘤突變負荷(TMB)的腫瘤所產(chǎn)生的非同義突變較多，對應的新抗原多，并且最有可能激活免疫系統(tǒng)促進腫瘤識別。與其他腫瘤相比，HCC通常表現(xiàn)為低到中等的TMB，平均每兆數(shù)據(jù)庫有5個體細胞突變，對應于大約60個非同義突變[5]。這可能是HCC對免疫治療原發(fā)耐藥的原因之一。在抗原提呈方面，TME中很大比例的樹突狀細胞(DC)可以表現(xiàn)出不成熟的表型，并伴有腫瘤抗原提呈和T細胞活化功能障礙[6]。主要組織相容性復合體(MHC)是抗原呈遞所必需的，在人類MHC通常被稱為人白細胞抗原(HLA)，抗原呈遞細胞通過HLA-I分子將抗原肽呈遞給細胞毒性 T 細胞來促進特異性免疫反應。HLA-I類分子的缺乏經(jīng)常發(fā)生在HCC中，并且與免疫抑制和免疫治療耐藥相關，而HCC中HLA-I類分子的高表達與改善的HCC預后密切相關[7]。

2.抑制性免疫微環(huán)境：HCC的TME是肝臟非實質常駐細胞、腫瘤細胞、免疫細胞和腫瘤相關成纖維細胞(CAF)組成的復雜且具有空間結構的整體。具有免疫活性 HCC 的特點是富含活化的輔助 CD4+T 和細胞毒性 CD8+T細胞浸潤，并且容易對ICI產(chǎn)生反應[1]。絕大多數(shù)HCC免疫微環(huán)境呈耗竭狀態(tài)，僅有一小部分具有免疫活性，大多數(shù)HCC患者免疫浸潤有限并存在大量免疫抑制性細胞,從而導致免疫抗性[8]。HCC中豐富的免疫抑制性細胞在TME中協(xié)同作用，并且與不良預后相關。HCC中較高的調節(jié)性T細胞(Treg)水平與不良預后相關，并且Foxp3+ Treg/CD4+T 細胞比率是總生存(OS)獨立的預后因素[9]。Treg 細胞介導了 HCC 中 T 細胞功能障礙[10]。腫瘤內 Treg 參與了抗 PD-1 抗性腫瘤和 PD-1hiCD8+T 細胞的發(fā)展[11]，表明在HCC中靶向Treg或是逆轉ICI耐藥的策略之一。腫瘤相關巨噬細胞(TAM)是 HCC 基質細胞的主要組成之一，具有極強的可塑性，可以極化為M1表型(促炎和免疫刺激表型)和M2表型(免疫抑制表型)[12]。其中M2型巨噬細胞通過上皮間質轉化(EMT)促進HCC侵襲性，并導致預后不良[13]。小鼠HCC模型中，高比例M2型TAM對ICI治療具有更強抗藥性[14]。鋅指蛋白64(ZFP64)在抗PD1耐藥HCC患者中上調，并促進巨噬細胞募集極化為M2抑制性表型，從而驅動HCC抗PD1抗性，而PKCα/ZFP64/CSF1通路抑制劑能夠克服HCC抗PD1耐藥性[15]。另外，TAM的清除也可能成為 PD-1 治療耐藥后的手段之一[16]。髓源性抑制細胞 (MDSC) 是一組異質的未成熟骨髓細胞，在腫瘤微環(huán)境中行使重要的免疫抑制功能。MDSC可以促進TAM極化為M2表型[8]，促進Treg形成及成纖維細胞分化為CAF[17]。已知循環(huán)MDSC與不良生存相關，并且較高的MDSC浸潤與HCC患者不良臨床預后相關[18]。在黑色素瘤中也發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中低MDSC頻率可提示免疫治療后患者能夠獲得較好的生存[19]。多種研究證實，靶向免疫微環(huán)境中抑制性細胞也是改善ICI耐藥重要研究方向之一。

3.信號通路及細胞因子：多種信號通路參與了HCC發(fā)生、發(fā)展，同時也有信號通路被明確證實參與了HCC免疫治療原發(fā)性耐藥。HCC小鼠模型研究證實，Wnt/β-catenin信號的激活促進了免疫逃逸及PD-1治療抗性。腫瘤細胞通過激活β-catenin信號，抑制趨化因子CCL5的表達，從而降低了CD103+樹突狀細胞、抗原特異性CD8+ T細胞的富集[20]。Wnt/β-catenin的激活可以預測HCC患者對于ICI的療效，并且基于免疫組化對β-catenin評估可以識別ICI反應良好的亞組[21]。使用臨床前模型證實，生物納米顆粒遞送siRNA下調β-catenin 能夠增強抗PD-1治療反應[22]。JAK1/2功能缺失既往已被證實參與了ICI獲得性耐藥，近年也發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞JAK1/2突變抑制了PD-L1表達上調，導致PD-1治療原發(fā)性耐藥[23]?？扇苄约毎蜃釉诮閷庖咧委熌退幹幸财鸬街匾饔谩GF-β在HCC中含量豐富，能夠促進腫瘤細胞增殖和侵襲。TGF-β1與PD-L1共表達預示著HCC較差的預后[24]。研究發(fā)現(xiàn)，尿路上皮癌中TGF-β能夠通過限制T細胞浸潤抑制抗腫瘤免疫，TGF-β阻斷聯(lián)合抗PD-L1抗體治療能夠加速腫瘤消退[25]。目前關于PD-1單抗聯(lián)合TGF-β抑制劑的臨床試驗(NCT02423343)也正在進行當中。

(二)獲得性耐藥 獲得性耐藥指ICI治療最初階段取得療效，但隨后疾病出現(xiàn)臨床和/或放射學的進展或復發(fā)。與原發(fā)性耐藥不同，在規(guī)避或逆轉ICI獲得性耐藥方面還沒有取得突破性進展，其機制的研究也因為缺少統(tǒng)一診斷標準、難以獲得良好的臨床樣本、大量DNA/RNA測序發(fā)現(xiàn)的差異基因較少等原因困難重重。目前關于ICI獲得性耐藥機制研究集中在黑色素瘤及非小細胞肺癌中較多。對于HCC，目前考慮可能與以下幾方面有關。

1.新抗原產(chǎn)生缺失：癌癥發(fā)展過程中，高TMB導致的新抗原表達量升高，有利于免疫系統(tǒng)識別腫瘤細胞從而增加ICI的療效，這一點在原發(fā)性耐藥中已詳述。但在獲得性耐藥中，使用ICI后腫瘤細胞和免疫系統(tǒng)的相互作用導致腫瘤內部發(fā)生克隆選擇，更多免疫原性或新抗原表達水平低的腫瘤細胞被保留，進而引發(fā)ICI的獲得性耐藥。此外，與其他原發(fā)腫瘤不同，肝臟多灶病變十分常見，盡管這些腫瘤在遺傳上起源于相似的細胞，但它們彼此之間存在顯著差異。隨著腫瘤內異質性的增加，免疫原性低的克隆更有可能被選擇，從而導致其對ICI敏感性降低[26]。總之，通過各方面因素導致腫瘤新抗原產(chǎn)生的缺失，是ICI獲得性耐藥的重要驅動機制。

2.免疫細胞耗竭及免疫檢查點上調：免疫細胞耗竭是指在癌癥發(fā)展及免疫治療過程中免疫細胞表現(xiàn)出功能障礙狀態(tài)。在疾病發(fā)展過程中發(fā)現(xiàn)多種免疫細胞出現(xiàn)上述耗竭表型。自然殺傷細胞(NK)作為固有免疫的第一道防線，通過分泌顆粒酶、穿孔素、TNF-α等殺傷腫瘤細胞。HLA-I類分子下調的肝癌細胞可避免其被細胞毒性T細胞特異性殺傷，而這類細胞的殺傷依賴于NK細胞的非特異性殺傷。在HCC TME中發(fā)現(xiàn)了耗竭表型的NK細胞，并伴隨IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生減少[27]。CD8+T細胞是免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤最主要的效應細胞之一。然而隨著疾病的發(fā)展，腫瘤抗原特異性CD8+T細胞逐漸出現(xiàn)耗竭表型，主要特點是殺傷效應受損以及伴隨其他抑制性免疫檢查點(TIM3、VISTA、TIGIT、LAG3等)的出現(xiàn)。HCC患者樣本中發(fā)現(xiàn)，表達多個免疫檢查點的嚴重耗竭 CD8+T 細胞的高度富集與較差的無進展生存期和總生存期相關，并且這種T細胞亞群可以作為HCC相關的新型生物標志物[28]。在長期的ICI治療過程中，HCC中多種免疫細胞的耗竭可能是ICI獲得性耐藥的潛在機制，并且多種針對于免疫檢查點抑制的聯(lián)合應用有望改善HCC患者預后。

三、展望

近年來，免疫治療在多種癌癥中發(fā)展迅速，極大地改善了患者的生存，甚至讓部分患者實現(xiàn)了長期的“帶瘤生存”。但這部分患者僅是龐大的癌癥患者群體中的小部分。如何篩選免疫治療的響應人群以及如何克服免疫治療耐藥是當前亟需攻克的科學問題。隨著組學技術、基因編輯技術、類器官培養(yǎng)技術的發(fā)展，未來對于ICI耐藥機制的探索會更加深入透徹。HCC中，免疫聯(lián)合抗血管生成治療已經(jīng)顯著提升了免疫單藥治療患者的總生存，其他聯(lián)合治療模式包括“免疫聯(lián)合免疫”、“免疫聯(lián)合靶向”、“免疫聯(lián)合放療”等也均在探索研究中。相信未來聯(lián)合治療策略將會改善ICI耐藥，為患者帶來更好的生存獲益。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。