許慧芬 韓開宇

由細(xì)菌、病毒或真菌等病原體引起的肺部感染在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，是導(dǎo)致生命死亡的主要原因之一[1-2]。作為一種呼吸道感染性疾病，肺部感染可引起多種并發(fā)癥[3]，特別是在基礎(chǔ)疾病多、免疫功能差的患者中[4]，將極大的影響患者的預(yù)后[5]。由于患病環(huán)境、患病人群、疾病嚴(yán)重程度、檢測(cè)技術(shù)的不同，致病微生物也不盡相同[6]。同時(shí)多種多重耐藥菌以及新型病原體的大量出現(xiàn)，也給臨床醫(yī)生在抗菌治療時(shí)帶來了挑戰(zhàn)[7]。因此盡早識(shí)別微生物病原體、確保精準(zhǔn)抗生素治療是至關(guān)重要的[8]。然而目前明確病原體的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)且檢出率低下[9]，在我國(guó)有近半數(shù)肺部感染患者的病因診斷尚不明確[6]，僅能在 30%～40% 的 CAP 患者中識(shí)別病原體[10-11]。新型的病原體診斷工具mNGS也因此備受青睞。mNGS 通過對(duì)提取的 DNA或RNA 進(jìn)行直接測(cè)序，可以對(duì)樣本中存在的幾乎所有病原體進(jìn)行無偏移檢測(cè)[12-13]。理論上mNGS不僅可以檢測(cè)臨床樣本中的任何微生物[14]，而且可以區(qū)分病原微生物和背景共生菌[15]。 mNGS以其快速且精準(zhǔn)的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，可幫助臨床迅速和準(zhǔn)確的控制感染[16-17]。

mNGS的原理和應(yīng)用

作為一種強(qiáng)大的病原體檢測(cè)工具，mNGS能在短時(shí)間內(nèi)(約16～24 h)一次性完成對(duì)上萬種病原體的檢測(cè)，在輔助判斷病原的同時(shí)，可獲取樣本中菌群的分布與占比信息。其檢測(cè)原理是將樣本中提取的核酸進(jìn)行片段化和測(cè)序接頭連接后進(jìn)行測(cè)序，獲得樣本中的核酸序列信息，再通過與微生物專用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，獲得宏基因組中包含的微生物的檢出列表。其測(cè)序過程主要包括兩個(gè)部分：濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)。濕實(shí)驗(yàn)操作包括樣品預(yù)處理、核酸提取、文庫構(gòu)建和測(cè)序。干實(shí)驗(yàn)生物信息學(xué)分析包括數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、人類序列去除、微生物物種序列的比對(duì)以及耐藥性或毒力基因分析[18-19]。

mNGS現(xiàn)已應(yīng)用于超過9個(gè)人體功能系統(tǒng)感染性疾病的病原體檢測(cè)，特別是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和局灶組織感染中[18, 20-25]。mNGS可以從各個(gè)系統(tǒng)不同臨床樣本中直接鑒定病原體，其準(zhǔn)確性和靈敏度均優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)[26]，且基本不受先前抗生素暴露的影響[21]，特別是對(duì)于新型的、罕見的、難以培養(yǎng)的病原體(如分枝桿菌、厭氧菌、奴卡菌等)[27]。此外，在病情危重、免疫力低下和混合病原體感染的患者中[28-31]，mNGS也發(fā)揮著極大的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前mNGS 還可以為進(jìn)化追蹤、預(yù)測(cè)抗生素耐藥性和證實(shí)毒力因子的存在提供基因信息，并可根據(jù)序列數(shù)推斷相關(guān)病原體的豐度[32-33]?？傊?，mNGS在感染性疾病的臨床應(yīng)用中顯示出巨大潛力。

mNGS在肺部感染病原體檢出中的應(yīng)用

一、細(xì)菌檢出

有研究發(fā)現(xiàn)在140例疑似肺部感染的患者中，mNGS診斷的敏感性遠(yuǎn)高于常規(guī)培養(yǎng)，而特異性卻相反，mNGS檢出最多的革蘭氏陽性細(xì)菌是微小微單胞菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌。檢出最多的革蘭氏陰性菌是流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌[34]；在329名重癥社區(qū)獲得性肺炎患者中，mNGS的細(xì)菌病原體檢出陽性率要高于常規(guī)檢測(cè)，mNGS檢出最多的細(xì)菌是肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌[35]；在72例呼吸機(jī)相關(guān)肺炎患者中，mNGS檢測(cè)陽性樣本的百分比也顯著高于常規(guī)檢測(cè)，特別是鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌[36]。同樣有研究顯示mNGS在檢測(cè)肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和普雷沃氏菌方面的陽性率顯著升高[28]。但另有研究發(fā)現(xiàn)，與mNGS相比，常規(guī)檢測(cè)能夠識(shí)別出大多數(shù)與細(xì)菌相關(guān)的肺炎[37]。這提示我們臨床醫(yī)生，mNGS的細(xì)菌病原體檢出陽性率和敏感性要優(yōu)于常規(guī)檢測(cè)，且mNGS不容易受到先前抗生素使用的影響[21, 38]。但是在肺部感染常見病原體的檢出中，mNGS是常規(guī)檢測(cè)的補(bǔ)充手段，并不能完全取代傳統(tǒng)培養(yǎng)。

二、真菌檢出

多項(xiàng)研究表明，mNGS在真菌病原體檢出方面發(fā)揮著巨大的優(yōu)勢(shì)。在疑似肺部真菌感染的106例患者中，mNGS在診斷肺部真菌感染方面的敏感性顯著高于常規(guī)檢測(cè)[39]。另一項(xiàng)研究中，常規(guī)培養(yǎng)僅在 1/21 樣本中鑒定出真菌性肺炎，而mNGS 卻在 19/21 樣本中鑒定出真菌性肺炎[40]。同樣在13例肺孢子蟲肺炎中，通過 mNGS 在所有患者中均檢測(cè)到肺孢子菌，而常規(guī)檢測(cè)僅在 5/13 樣本中檢測(cè)到肺孢子菌[41]。但是也有研究提出不同觀點(diǎn)，即mNGS在真菌檢出方面與常規(guī)檢測(cè)相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[21,28]。更有研究顯示對(duì)于某些真菌病原體，常規(guī)檢測(cè)陽性率要高于mNGS，如白色念珠菌和熱帶念珠菌[36]。與之相似，有研究提出mNGS在隱球菌檢測(cè)方面敏感性低于血清抗原檢測(cè)[21]；造成這些差異結(jié)果的原因，可能與不同研究中患者病情嚴(yán)重程度、患病環(huán)境、采樣標(biāo)本不同相關(guān)。總之，對(duì)于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)難以發(fā)現(xiàn)和明確的真菌感染，mNGS技術(shù)是臨床醫(yī)生的推薦選擇。

三、病毒檢出

目前mNGS是發(fā)現(xiàn)病毒的首選方法，特別是對(duì)于新出現(xiàn)的引起肺炎的病毒(如 SARS、MERS和H7N9)，mNGS有助于追蹤和控制爆發(fā)[42]。此外mNGS還具有識(shí)別常規(guī)檢測(cè)方法難以檢測(cè)到的額外病毒的潛力[43]。在一項(xiàng)171 名肺部感染患者的研究中，mNGS檢出病毒60例，最常檢測(cè)到的病毒是人皰疹病毒5型、人皰疹病毒 4 型、人細(xì)小病毒 B19等，而常規(guī)檢測(cè)方法幾乎對(duì)所有病毒都呈陰性[29]。另一項(xiàng)對(duì)72名肺部感染患者的研究中，mNGS檢出病毒30例，同樣常規(guī)檢測(cè)方法、病毒檢測(cè)均為陰性[36]。但是，也有研究表明對(duì)于常見呼吸道病毒的檢出，mNGS的敏感性低于PCR，如甲型流感病毒和鼻病毒[43]。造成這一結(jié)果的原因可能是在測(cè)序過程中，mNGS僅進(jìn)行了DNA測(cè)序，故只檢測(cè)到DNA病毒，而PCR法可以檢測(cè)RNA病毒，如甲型流感病毒和乙型流感病毒[44]，故在一定程度上影響了病毒的檢出。大量研究已證實(shí)，mNGS的診斷效能，優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法。如今，mNGS通過測(cè)序獲得的病原體信息不僅可以指導(dǎo)臨床抗病毒藥物的使用(包括藥物的啟動(dòng)、升級(jí)、降級(jí)或停藥)，而且可以通過使用mNGS技術(shù)評(píng)估嚴(yán)重下呼吸道病毒感染患者的預(yù)后[45]。

四、罕見及新型病原體的檢出

mNGS因其無偏移的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，在不明原因肺炎的病因診斷中起著至關(guān)重要的作用，尤其是對(duì)于新型的、罕見的以及傳統(tǒng)檢測(cè)方法難以培養(yǎng)的病原體[21, 46-47]。在一項(xiàng)納入159名肺部感染患者的大規(guī)模多中心前瞻性研究中，mNGS在識(shí)別引起肺部感染，難以培養(yǎng)的、非典型微生物方面(如軍團(tuán)菌、肺炎支原體、鸚鵡熱衣原體、非結(jié)核分枝桿菌)發(fā)揮了重要價(jià)值[48]。眾所周知，由于苛刻的生長(zhǎng)要求、有限的檢測(cè)方法和非特異性臨床表現(xiàn)，診斷軍團(tuán)菌肺炎具有挑戰(zhàn)性，而mNGS檢測(cè)提高了軍團(tuán)菌的檢出率，極大地改善了因軍團(tuán)菌所致重癥肺炎患者的預(yù)后[49]。mNGS技術(shù)不僅打開了認(rèn)識(shí)病原體的大門，而且為臨床醫(yī)生了解微生物的特點(diǎn)和指導(dǎo)用藥，也提供了巨大的幫助。例如，通過mNGS技術(shù)可以檢測(cè)到鸚鵡熱衣原體、奴卡菌等罕見病原體，通過總結(jié)患者的臨床特征、檢驗(yàn)和檢查結(jié)果、影像學(xué)特征、治療和預(yù)后等，使臨床醫(yī)生更好地了解疾病，從而日后可早期識(shí)別疾病，減少不必要的抗生素使用，縮短病程[27, 50]。

mNGS在免疫功能低下患者群體中的應(yīng)用

有研究發(fā)現(xiàn)在免疫功能受損的社區(qū)獲得性肺炎患者BALF樣本中，常規(guī)檢測(cè)方法在 6/13樣品中鑒定出病原體，而mNGS 在12/13樣品中鑒定出病原體。且研究發(fā)現(xiàn)肺孢子菌和巨細(xì)胞病毒是這13名患者中最常見的病原體[51]；當(dāng)mNGS應(yīng)用于造血干細(xì)胞移植合并急性呼吸道疾病患者的BALF時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于某些呼吸道微生物(如呼吸道合胞病毒、嗜麥芽窄食單胞菌、人皰疹病毒6型、巨細(xì)胞病毒等)，mNGS的診斷敏感性可達(dá)100%[52]；不僅如此，通過mNGS技術(shù)，臨床醫(yī)生對(duì)免疫功能受損患者的致病微生物譜有了新的認(rèn)識(shí)。例如，研究發(fā)現(xiàn)，在免疫功能受損患者群體中，肺孢子菌和巨細(xì)胞病毒的感染率更高，而肺炎支原體感染率顯著降低，同時(shí)存在著更多潛在致病病原體感染，更多混合病原體感染[53]。與前述研究相一致，對(duì)免疫功能低下和免疫功能正常的重癥社區(qū)獲得性肺炎患者進(jìn)行BALF的mNGS檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)在免疫功能低下的SCAP患者中，檢出了更多的肺孢子菌、白色念珠菌和人類皰疹病毒5型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了更多的混合病原體感染[54]。此外，利用mNGS還可以揭示中國(guó)大陸肺部感染ICU入院患者的抗生素耐藥菌譜[55]。一直以來，免疫功能受損肺炎患者的死亡率高于免疫功能正常肺炎患者[12]。上述研究均表明，mNGS在免疫功能低下患者的病原體檢出中具有優(yōu)勢(shì)，mNGS可以幫助臨床醫(yī)生認(rèn)識(shí)病原譜，指導(dǎo)疾病的治療，改善患者預(yù)后，降低死亡率。

肺部感染患者不同樣本的比較

在現(xiàn)有研究中，為明確肺部感染病原體，mNGS可采用的樣本有BALF、肺組織、胸水、痰液、咽拭子、外周血等，不同樣本類型病原體檢出的敏感性和特異性略有差異。針對(duì)BALF樣本，Chen等人通過對(duì)235名疑似肺部感染患者的BALF進(jìn)行mNGS檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)mNGS的敏感性和特異性分別為88.89%和14.86%。排除罕見病原體后，其敏感性降低至73.33%，特異性提高至41.71%[56]；針對(duì)肺組織樣本，Li等人在20例肺部感染患者的肺組織中進(jìn)行mNGS檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)mNGS的敏感性和特異性分別為100.0%和 76.5%[16, 28]；同樣Guo等人也進(jìn)行了肺組織樣本的mNGS檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)，與培養(yǎng)相比，mNGS的敏感性為83.3%，特異性為79.1%。值得一提的是，該研究首次建立了在肺組織樣本中基于Illumina平臺(tái)同時(shí)檢測(cè)病原體和癌癥的管道[57]；將BALF與肺組織樣本對(duì)比，研究發(fā)現(xiàn)在肺組織中mNGS的特異性高于BALF，但BALF的敏感性更高[58]；將BALF與痰液標(biāo)本對(duì)比，研究發(fā)現(xiàn)兩樣本對(duì)于病原體檢出的敏感性和特異性無顯著差異，且在檢測(cè)結(jié)果中具有顯著一致性[59]；將BALF與血液標(biāo)本對(duì)比，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于細(xì)菌和真菌檢測(cè)，BALF比血液更敏感，但兩者的特異性卻沒有顯著差異[60]。也有研究表明，mNGS在血液中檢測(cè)到的病毒總體上比 BALF多，但是在某些患者的BALF中，mNGS檢測(cè)到某種特定病毒的序列卻比血液多，如EB病毒、巨細(xì)胞病毒等[61-62]；將經(jīng)皮肺活檢(TBLB)、支氣管刷檢(BB)、BALF三種樣本對(duì)比，研究發(fā)現(xiàn)不同樣本類型之間敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而mNGS在TBLB 標(biāo)本中具有最高的特異性，其次是 BB，最后是 BALF，綜合敏感性和特異性，BB標(biāo)本優(yōu)于TBLB和BALF標(biāo)本[40]；將BALF、痰、血漿、鼻咽拭子等多樣本進(jìn)行mNGS檢測(cè)比較，研究發(fā)現(xiàn)BALF和痰液是檢測(cè)病原體最有效的樣本類型，陽性率為75%，而外周血樣本只有35%的陽性結(jié)果[53]。

綜上，結(jié)合各項(xiàng)研究結(jié)果以及我們的臨床經(jīng)驗(yàn)，mNGS在呼吸道不同樣本類型之間敏感性幾乎沒有差異。在實(shí)際臨床工作中，BALF在重癥肺炎患者床頭支氣管鏡下容易獲取，且代表了肺泡水平的成分，更適用于干咳或無咳嗽咳痰的肺部感染患者[63]。但是對(duì)于患者來講，他們很難接受侵入性操作，甚至?xí)虼水a(chǎn)生緊張焦慮的心情。同樣肺組織標(biāo)本的獲取也需要經(jīng)過有創(chuàng)操作，其更適用于外周肺部感染難以明確病原體的患者。相比之下痰液和咽拭子臨床容易獲取，而且病人容易接受，但是痰和咽拭子標(biāo)本極易受到污染，對(duì)于鑒定病原體是致病菌還是污染菌有一定難度。而對(duì)于血液標(biāo)本，我們需要認(rèn)識(shí)到血液中的病原體DNA可能反映了肺部感染，也可能是來自身體其他部位的感染[64]。這均提示我們臨床醫(yī)生，在面對(duì)肺部感染的患者時(shí)，要根據(jù)患者的臨床特點(diǎn)，感染病灶位置、以及病情嚴(yán)重程度等綜合考慮，個(gè)體化選取最佳的采樣標(biāo)本。

mNGS的局限性

目前，mNGS在肺部感染臨床實(shí)際應(yīng)用中，仍存在一些問題：首先，肺部本身不是無菌環(huán)境，在樣本采集過程中也不能保證絕對(duì)無菌，而mNGS 不僅可以檢測(cè)到感染病原體，還反映了正常的微生物菌、定植菌和樣本污染菌，這給mNGS 的病原體解釋帶來了挑戰(zhàn)。其次RNA測(cè)序難以進(jìn)行，RNA檢測(cè)可以同時(shí)識(shí)別死亡和存活的病原體，并可以區(qū)分過去和當(dāng)前的感染，然而人源RNA的豐度和復(fù)雜度較DNA高，并且容易降解，這對(duì)樣品的運(yùn)輸和儲(chǔ)存提出了更高的要求，也因此限制了RNA的檢出[65]。最后，mNGS測(cè)序成本較高，且尚未納入醫(yī)保范圍之內(nèi)，患者個(gè)人承擔(dān)費(fèi)用較高，在一定程度上限制了mNGS的推廣使用。

結(jié) 語

綜上所述，mNGS在肺部感染病原體檢測(cè)中發(fā)揮著巨大的優(yōu)勢(shì)，其對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等病原體的檢出具有診斷價(jià)值，甚至可以檢出新型的、罕見的、難以培養(yǎng)的病原體，尤其適用于免疫功能低下的患者群體。針對(duì)肺部感染患者應(yīng)采集的不同臨床樣本，臨床醫(yī)生需結(jié)合患者的實(shí)際情況進(jìn)行選擇。目前mNGS技術(shù)尚不能完全取代傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，但可作為強(qiáng)大的補(bǔ)充手段發(fā)揮優(yōu)勢(shì)。未來隨著技術(shù)的不斷完善，mNGS有望在臨床工作中發(fā)揮更大的價(jià)值。