徐林成 邵偉偉 鄒琳 管燕燕

截止2020年肺癌是世界范圍內(nèi)總?cè)巳喊l(fā)病率第二、死亡率第一的惡性腫瘤[1]，在我國它的發(fā)病率及死亡率均排首位[2]。臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)NSCLC中腺癌的發(fā)病率，較鱗狀細(xì)胞癌呈顯著上升趨勢(shì)[3-4]，達(dá)肺癌總?cè)巳旱?0%，從生物學(xué)行為上看，腺癌更具有侵襲性、預(yù)后更差，隨著一、二、三代表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKI)在臨床工作中的使用，腺癌患者的中位總生存期已經(jīng)從化療時(shí)代的12個(gè)月左右延長(zhǎng)到三代EGFR-TKI時(shí)代的38.6個(gè)月，明顯地改善了患者的預(yù)后。本文同時(shí)檢測(cè)了195例肺腺癌患者手術(shù)切除標(biāo)本中EGFR蛋白和基因，通過分析它們與臨床病理因素間的以及兩者間的相互關(guān)系，希望能通過經(jīng)濟(jì)、便捷的手段篩選出潛在可能的基因突變患者。

資料與方法

一、一般資料

收集南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城市第一人民醫(yī)院病理科2016年4月至2021年9月間手術(shù)切除的195例肺腺癌患者臨床病理資料，手術(shù)方式為肺葉或肺段切除，所有病例術(shù)前均未行放、化療，同時(shí)取癌周3CM處正常肺組織為對(duì)照組。所有標(biāo)本嚴(yán)格按照病理質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化流程操作，進(jìn)行取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色。本實(shí)驗(yàn)通過南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫審號(hào)【2021】-(K-87))。

二、試劑

EGFR蛋白(即用型，兔單抗，克隆號(hào)EP22，福建邁新公司)以及內(nèi)源性過氧化物酶全都購自福州邁新公司，二抗及DAB購自上海譽(yù)源公司；石蠟組織DNA提取試劑盒 (ADx-FF01、ADx-TI03)、 EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(ADx-EAR01-SL、ADx-EG01-SL)均購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司。

三、主要設(shè)備

LEICA BOND-MAX全自動(dòng)免疫組化儀；國產(chǎn)宏石全自動(dòng)熒光定量PCR儀(SLAN-96S)；德國艾本德離心機(jī)及移液器；美國科威爾6000超微量分光光度計(jì)。

四、方法

1 免疫組織化學(xué)：手術(shù)標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定后取材，常規(guī)石蠟包埋后4μm切片，使用LEICA BOND-MAX 全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行EGFR蛋白檢測(cè)。每例均設(shè)有陽性對(duì)照片。

2 EGFR基因突變檢測(cè)(ARMS法)：顯微鏡下觀察HE切片，圈出腫瘤區(qū)域，連續(xù)4μm切片，去除非腫瘤組織,收集蠟片于離心管中，按核酸提取SOP抽提DNA，用Quawell6000分光光度計(jì)檢測(cè)樣品濃度和純度，質(zhì)控合格后按照試劑盒說明書混好DNA樣品，依次加入8連管試劑反應(yīng)條，上機(jī)擴(kuò)增檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，外控由 FAM 信號(hào)指示,內(nèi)控由 VIC信號(hào)指示。

五、結(jié)果判讀

1 免疫組化：EGFR陽性染色定位于細(xì)胞膜/少量胞漿，依據(jù)著色細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量評(píng)價(jià)。著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比≤5% 計(jì)0分；6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分；染色強(qiáng)度依據(jù)未著色、著淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)0～3分。將每張切片著色細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度得分相加，0～1分為(-)，2～3分為(1+)，4～6分為(2+)，>6分為(3+)。

2 基因檢測(cè)：樣品突變信號(hào)(FAM信號(hào))對(duì)應(yīng)的Ct值為突變Ct值；樣品對(duì)應(yīng)的外控信號(hào)(FAM信號(hào))為外控Ct值。ΔCt值=突變Ct值-外控Ct值。按說明書要求，確定樣品各個(gè)反應(yīng)管各自的突變Ct值，然后確定該樣品的外控Ct值。根據(jù)不同的突變Ct值，判定樣品的檢測(cè)結(jié)果。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5對(duì)取得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。率的比較采用Pearson χ2檢驗(yàn)以及Fisher確切概率法，配對(duì)樣本采用McNemar檢驗(yàn)和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均采用α=0.05。

結(jié) 果

一、臨床病理特征

本組實(shí)驗(yàn)中男性患者99例，女性患者96例；年齡37～82歲，平均年齡62.97±9.31歲，中位年齡64歲；有吸煙66例(33.85%)，無吸煙129例(66.15%)；腫瘤中位大小3 cm，67例>3 cm(34.36%)，128例≤3 cm(65.64%)；依據(jù)顯微鏡下組織學(xué)形態(tài)(貼壁、腺泡、乳頭、實(shí)體、微乳頭、篩狀等)確定分化程度，其中，低分化43例(22.05%)，中分化113例(57.95%)，高分化39例(20.00%)；47例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(24.10%)；據(jù)國際抗癌聯(lián)盟2017年第八版肺癌TNM分期，其中I期97例(49.74%)，Ⅱ期71例(36.41%)，Ⅲ期27例(13.85%)。

二、EGFR蛋白在正常肺組織及肺腺癌組織中的表達(dá)

EGFR蛋白在195例正常肺組織及腺癌組織中的陽性表達(dá)率分別為24.62%(48/195)、76.92%(150/195)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見表1,圖1～4)。

表1 EGFR蛋白在正常肺組織及肺腺癌組織中的表達(dá)

圖1 EGFR蛋白在正常肺組織陰性表達(dá)(SP×200) 圖2～4 EGFR蛋白分別在肺腺癌組織中陰性、中等程度、強(qiáng)陽性表達(dá)(SP×200)

三、腺癌組織中EGFR蛋白及基因表達(dá)與臨床病理因素間的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)195例肺腺癌組織中EGFR蛋白的表達(dá)與腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P均<0.05)，但與患者性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、是否吸煙、腫瘤分化程度無關(guān)(P均>0.05)。本組實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變率為71.79%(140/195)，主要突變形式為18～21號(hào)外顯子的點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變等(圖5～8)，其中3例為E18-P.G719X，64例為E19-del，4例為E20-T790M/S768I/S858R/Ins，67例為E21-L858R/L861Q，另有2例分別為E19-Del和E20-T790M 以及E20-T790M和E21-L858R混合突變型。EGFR基因突變率與患者性別、是否吸煙相關(guān)(P均<0.05)，但與患者年齡、腫瘤發(fā)生部位及大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度及TNM分期無關(guān)(P均>0.05)。聯(lián)合分析EGFR蛋白表達(dá)及基因突變與臨床病理因素間的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)二者的共表達(dá)情況與腫瘤大小、分化程度、TNM分期相關(guān)(P均<0.05)。進(jìn)一步分析E19及E21與臨床病理因素間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除E21突變與性別有關(guān)外(P<0.05)，其余均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(見表2～3)。

表2 EGFR蛋白、EGFR基因與臨床病理因素間的關(guān)系

表3 E19、E21與臨床病理因素間的關(guān)系

四、肺腺癌組織中EGFR蛋白與基因突變間的關(guān)系

45例蛋白陰性表達(dá)組中基因突變率為31.11%，150例蛋白陽性表達(dá)組中基因突變率為84.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-8.912，P<0.001)(見表4)。

表4 EGFR蛋白及基因表達(dá)間的關(guān)系

討 論

隨著病理學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)等相關(guān)學(xué)科對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究的深入及成果的轉(zhuǎn)化，腫瘤的治療已經(jīng)從傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療時(shí)代邁入了“個(gè)體化、精準(zhǔn)化”治療時(shí)代，其中靶向治療是近20年最偉大的創(chuàng)新之一。隨著1998年第一個(gè)靶向藥(赫賽汀)在美國獲批使用后，目前國內(nèi)外已陸續(xù)上市有針對(duì)包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的靶向藥物(如腎癌、胃癌、結(jié)直腸癌、惡性淋巴瘤等)，極大的改善了患者的預(yù)后。肺癌由于惡性度高，5年生存率僅為20%左右，因此對(duì)它的研究一直是科研、臨床工作的熱點(diǎn)。盡管已經(jīng)明確在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中涉及到多種基因改變(如EGFR/Braf/Kras/Nras/ALK/ROS1/HER-2/PIK3A等)，但是絕大部分靶向治療獲益者依然表現(xiàn)為EGFR基因的突變。近年來國內(nèi)文獻(xiàn)[5-7]報(bào)道EGFR在肺癌總?cè)巳褐械耐蛔兟蕿?40%～50%左右，在腺癌中的突變率為50%～60%。

圖5～8 E18-P.G719X；E19-P.Del；E20-P.Ins；E21-P.L858R曲線

EGFR蛋白是一種跨膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體(RTK)，是原癌基因HER-1的表達(dá)產(chǎn)物，位于人7號(hào)染色體短臂，與相應(yīng)配體(如上皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α等)結(jié)合后可被激活，形成二聚體，從而啟動(dòng)酪氨酸激酶(TK)和多個(gè)下游效應(yīng)因子，已在多種腫瘤中[8-11]發(fā)現(xiàn)活化的EGFR可參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)EGFR蛋白的陽性表達(dá)率隨著腫瘤體積的增大、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的升高而升高，卻與患者性別、年齡等無關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。然而也有研究[13]認(rèn)為在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組EGFR蛋白陽性表達(dá)率要高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，原因一方面可能是存在標(biāo)本異質(zhì)性，另一方面可能是由于我們僅入組了腺癌病例，而腺癌較其它非小細(xì)胞肺癌類型如鱗狀細(xì)胞癌，惡性度更高且更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[14]，活化的EGFR參與了瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步分析其發(fā)生機(jī)制：EGFR基因存在突變，本實(shí)驗(yàn)195例肺腺癌患者中有140例出現(xiàn)EGFR基因突變，突變的EGFR具有配體非依賴型受體的細(xì)胞持續(xù)活化作用，通過激活，參與細(xì)胞增殖的Ras/MAPK通路和抗細(xì)胞凋亡的PI3K/Akt通路以及蛋白激酶C信號(hào)級(jí)聯(lián)等途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖；我們先前研究[15]發(fā)現(xiàn)肺腺癌中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)率顯著高于正常肺組織，且與腫瘤的惡性進(jìn)展相關(guān)(高TNM分期、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)、腫塊體積增大)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中EGFR的表達(dá)情況，推測(cè)EGFR可通過調(diào)節(jié)VEGF的水平從而促進(jìn)腫瘤血管的新生，導(dǎo)致腫瘤體積增大、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。EGFR基因的突變形式主要為點(diǎn)突變、缺失、插入突變等，目前檢測(cè)方法主要有原位雜交(FISH)、Sanger測(cè)序、二代測(cè)序(NGS)、實(shí)時(shí)PCR、ARMS-qPCR等，本實(shí)驗(yàn)采用的是ARMS-qPCR法，檢出率為71.79%(140/195)，稍高于文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，分析其原因一方面是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)人群男女比例相當(dāng)，在96例女性患者中高達(dá)82.29%檢測(cè)出有EGFR基因突變；另一方面本實(shí)驗(yàn)只納入了腺癌，排除了其他組織學(xué)類型，因此陽性檢出率有所提升。分析EGFR基因突變與臨床病理因素間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，其在女性、不吸煙人群中突變率顯著高于其它組別，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)中我們同時(shí)觀察了EGFR蛋白與基因在肺腺癌中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變率在EGFR蛋白陽性表達(dá)組顯著高于陰性表達(dá)組，結(jié)合兩者與臨床病理因素間的關(guān)系說明了當(dāng)EGFR基因突變時(shí)，分子構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致EGFR蛋白處于持續(xù)激活狀態(tài)，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過度生長(zhǎng)。基于這種情況，近年來國內(nèi)外研發(fā)的EGFR-TKI(如吉非替尼、阿法替尼、奧西替尼等)通過直接作用于EGFR胞內(nèi)蛋白酪氨酸激酶(TK)，與ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TK功能域，可逆或不可逆抑制酪TK磷酸化，進(jìn)而抑制下游信號(hào)通路(Ras/MAPK、PI3K/Akt等)從而阻斷腫瘤細(xì)胞的過度生長(zhǎng)，顯著改善了患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。

2020年《CSCO非小細(xì)胞肺癌診療指南》已將EGFR-TKI類藥物列入一線治療I級(jí)推薦，但是這些藥物使用的前提是患者需要檢測(cè)出EGFR基因存在突變。如前所述目前主流的檢測(cè)方法由于耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)難度大、對(duì)實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高、價(jià)格昂貴且多為非醫(yī)保項(xiàng)目，限制了其在基層醫(yī)院的應(yīng)用，但是免疫組化方法檢測(cè)蛋白的表達(dá)既經(jīng)濟(jì)又簡(jiǎn)單易行，一般基層醫(yī)院都可開展，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)對(duì)于EGFR蛋白及基因在肺腺癌中的表達(dá)情況及兩者間關(guān)系的分析，我們建議對(duì)于無法常規(guī)進(jìn)行基因檢測(cè)的情況下重點(diǎn)關(guān)注女性、不吸煙、腺癌，且EGFR蛋白高表達(dá)的人群。