黃凱達，范鑫，鄭志高，李雯雯，林雨標

廈門市海滄醫(yī)院腫瘤科，福建 廈門 361026

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一。中國惡性腫瘤流行病學數(shù)據(jù)顯示，肝癌發(fā)病率居全部惡性腫瘤第四位，病死率居全部惡性腫瘤第二位[1]。腫瘤復發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移是導致HCC患者預后不良的重要因素。深入了解腫瘤復發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制對于改善HCC患者預后具有重要意義。磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的信號通路，該信號通路通過多種生長因子與受體結合而被激活，介導腫瘤細胞的增殖、遷移以及自我更新等過程，進而影響腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。阻斷PI3K/AKT信號通路可以阻斷細胞周期進程，促進肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及腫瘤新生血管生成，進而抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[3-4]。鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）是最大的序列特異性DNA結合蛋白家族，通過調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。ZNF通過PI3K/AKT信號通路促進惡性腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移，有望成為治療惡性腫瘤的靶點[6]。ZNF488是一種Krüppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子，已被證實為致癌基因，可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)胰腺癌細胞的生物學行為[7]，但其在HCC中的功能及作用機制目前尚不清楚。本研究探討ZNF488對HCC細胞增殖、凋亡、遷移與侵襲的影響，期望能為HCC的靶向治療提供新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院細胞庫。DNA提取試劑盒、pLL3.7-ZNF488 shRNA載體質(zhì)粒及PI3K、AKT、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗體試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞均購自上海信裕生物科技有限公司，Lipofectamin 3000、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DMEM細胞培養(yǎng)基均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，CCK8試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢普諾賽生命科技有限公司，限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和SacⅠ均購自美國NEB公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司。酶標儀購自邁瑞公司，顯微鏡購自美國FEI公司，流式細胞儀購自德國Partec公司，蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 ZNF488穩(wěn)定敲除細胞系的構建

利用麻省理工學院的規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）在線設計工具（http://crispr.mit.edu/）設計出靶向ZNF488的20 bp的靶向序列小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA），合成后的2條單鏈DNA退火形成雙鏈DNA，pLL3.7-ZNF488 shRNA載體經(jīng)BbsⅠ酶切后與雙鏈引物連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選出若干陽性克隆，測序驗證后選取正確序列的質(zhì)粒進行大提。利用Lipofectamin 3000試劑將構建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細胞中，挑選若干綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）陽性的細胞進行單克隆培養(yǎng)，提取基因組后擴增出相應靶基因序列，測序分析并對堿基缺失結果進行比對分析，選取基因缺失正確的細胞克隆，篩選出穩(wěn)定敲除ZNF488的HepG2細胞（pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組）。同時，將轉(zhuǎn)染pLL3.7-ZNF488 shRNA空載質(zhì)粒的HepG2細胞（pLL3.7-ZNF488 shRNA組）和正常的HepG2細胞（HepG2組）作為對照。

1.3 CCK8法檢測細胞增殖能力

收集各組細胞，2000/孔接種于96孔板中，加入等量的DMEM完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)0、24、48、72 h后，每 100 μl培養(yǎng)液中加入 10 μl CCK8 試劑，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，采用酶標儀檢測各孔在450 nm處的光密度（optical density，OD）值。上述步驟重復3次。以時間為橫坐標、OD值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況及細胞周期

轉(zhuǎn)染前16～24 h，以3×104/孔將細胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞；采用含0.5%血清的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗2次；采用預冷的2%～4%多聚甲醛（pH=7.4）在-20℃條件下固定15 min，再在70%乙醇中固定過夜；離心去除上清后，用含0.5%血清的PBS沖洗2次，細胞重懸于RNase A緩沖液（50 μg/ml）中，37 ℃避光消化 30 min；加入 400 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）（100 μg/ml），室溫染色 30 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況及細胞周期各時相的分布情況。上述步驟重復3次。

1.5 Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

將Matrigel膠和無血清培養(yǎng)基混勻放入Transwell小室，對基底膜進行包被。3組細胞離心后用無血清的培養(yǎng)液重懸細胞后計數(shù)，置入Transwell小室中，放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24 h后，擦除多余的液體Matrigel膠，采用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下觀察結晶紫染色細胞數(shù)即為侵襲細胞數(shù)目。上述步驟重復3次。遷移實驗：除了不對Transwell小室基底膜進行包被外，其余步驟同侵襲實驗。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測ZNF488蛋白及PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達情況

將HepG2組、pLL3.7-ZNF488 shRNA組、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組細胞裂解、變性，提取細胞總蛋白。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測蛋白濃度，蛋白樣品中加入上樣緩沖液，沸水浴變性5 min后，加至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中，凝膠電泳后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封閉并進行抗體孵育，采用電化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色試劑盒進行顯色。采用Quantity One圖像分析軟件對Western blot實驗結果進行分析。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，計算p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K蛋白相對表達量，目的蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個蛋白樣品設3個重復。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組別HepG2細胞中ZNF488蛋白相對表達量的比較

HepG2組、pLL3.7-ZNF488 shRNA組、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組HepG2細胞中ZNF488蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組 HepG2細胞中ZNF488蛋白相對表達量低于HepG2組和pLL3.7-ZNF488 shRNA組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組別HepG2細胞中ZNF488蛋白相對表達量的比較（±s）

表1 不同組別HepG2細胞中ZNF488蛋白相對表達量的比較（±s）

注：*與pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組比較，P＜0.05

組別HepG2組pLL3.7-ZNF488 shRNA組pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組F值P值0.98±0.11*0.97±0.15*0.13±0.01 57.744 0.01 ZNF488蛋白表達

2.2 不同組別HepG2細胞增殖情況的比較

培養(yǎng)24 h，HepG2組、pLL3.7-ZNF488 shRNA組、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組HepG2細胞OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；培養(yǎng)48、72 h，HepG2組、pLL3.7-ZNF488 shRNA 組、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組HepG2細胞OD值比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。培養(yǎng)48、72 h，pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組HepG2細胞OD值均低于HepG2組和pLL3.7-ZNF488 shRNA組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同時間不同組別HepG2細胞OD值的比較（±s）

表2 不同時間不同組別HepG2細胞OD值的比較（±s）

注：*與同時間pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組比較，P＜0.05

組別HepG2組pLL3.7-ZNF488 shRNA組pLL3.7-ZNF488 shRNAZNF488組F值P值0.26±0.15 0.25±0.12 0.21±0.08 0.145 0.868 0.63±0.16*0.56±0.11*0.24±0.08 8.823 0.016 0.83±0.18*0.75±0.16*0.32±0.12 9.352 0.014 24 h 48 h 72 h

2.3 不同組別HepG2細胞凋亡情況和細胞周期的比較

HepG2組、pLL3.7-ZNF488 shRNA組、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組HepG2細胞凋亡率、G2期細胞所占百分比比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組細胞凋亡率、G2期細胞所占百分比均高于HepG2組和pLL3.7-ZNF488 shRNA組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同組別HepG2細胞凋亡情況和細胞周期的比較（%，±s）

表3 不同組別HepG2細胞凋亡情況和細胞周期的比較（%，±s）

注：*與pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組比較，P＜0.05

組別 凋亡率G2期細胞所占百分比?

2.4 不同組別HepG2細胞侵襲和遷移情況的比較

HepG2組、pLL3.7-ZNF488 shRNA組、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組HepG2細胞侵襲細胞數(shù)目、遷移細胞數(shù)目比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組 HepG2細胞侵襲細胞數(shù)目、遷移細胞數(shù)目均低于HepG2組和pLL3.7-ZNF488 shRNA組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表4）

表4 不同組別HepG2細胞侵襲和遷移情況的比較（±s）

表4 不同組別HepG2細胞侵襲和遷移情況的比較（±s）

注：*與pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組比較，P＜0.05

組別HepG2組pLL3.7-ZNF488 shRNA組pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組F值P值46.21±3.63*43.57±3.79*15.23±1.52 88.935＜0.01 68.52±6.72*53.28±5.96*19.61±2.76 63.843＜0.01侵襲細胞數(shù)目 遷移細胞數(shù)目

2.5 不同組別HepG2細胞中PI3K/AKT信號通路相關蛋白相對表達量的比較

HepG2組、pLL3.7-ZNF488 shRNA組、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組HepG2細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；HepG2組、pLL3.7-ZNF488 shRNA組、pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組HepG2細胞中AKT、PI3K相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組HepG2細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白相對表達量均低于HepG2組和pLL3.7-ZNF488 shRNA組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表5）

表5 不同組別HepG2細胞中PI3K/AKT信號通路相關蛋白相對表達量的比較（±s）

表5 不同組別HepG2細胞中PI3K/AKT信號通路相關蛋白相對表達量的比較（±s）

注：*與pLL3.7-ZNF488 shRNA-ZNF488組比較，P＜0.05

組別HepG2組pLL3.7-ZNF488 shRNA組pLL3.7-ZNF488 sh-RNA-ZNF488組F值P值p-AKT 1.00±0.13 0.97±0.15 0.23±0.078*38.648＜0.01 AKT 0.97±0.12 0.99±0.13 0.93±0.11 0.194 0.829 p-PI3K 0.98±0.09 0.96±0.15 0.30±0.06*39.404＜0.01 PI3K 0.99±0.18 0.97±0.11 0.95±0.12 0.061 0.941

3 討論

肝癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，手術、射頻消融治療和化療均能有效殺滅腫瘤細胞，但治療后轉(zhuǎn)移和復發(fā)的比例非常高，常導致患者治療效果不佳及預后不良。惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程與細胞外基質(zhì)降解、細胞骨架變化、腫瘤細胞黏附和運動、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄因子激活、間充質(zhì)基因的表達及血管生成等有關。分子靶向治療作用于HCC發(fā)生發(fā)展過程中涉及的特異性分子及其調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導通路，在抑制腫瘤細胞增殖、延緩復發(fā)轉(zhuǎn)移以及改善患者預后等方面具有一定的優(yōu)勢，正逐漸成為HCC治療的重要手段。開發(fā)有效的肝癌生物標志物和治療靶點對肝癌治療具有重要意義。

PI3K/AKT是許多信號分子的下游信號轉(zhuǎn)導通路，在促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用，近年來，在許多種惡性腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的過度激活。研究表明，PI3K/AKT信號通路異常活化與腫瘤生長、增殖、凋亡、血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移有關，并因此影響患者的預后[8]。PI3K/AKT信號通路通過與上下游靶點的協(xié)同作用調(diào)控腫瘤多重耐藥，影響細胞對化療藥物的敏感性[9-10]。PI3K/AKT信號通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。王開瓊等[11]研究顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）-182過表達可能通過激活PI3K/AKT信號通路調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶9、c-Myc和血管內(nèi)皮生長因子的表達，從而促進HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲。羅彩云等[12]研究顯示，沉默脂肪細胞增強子結合蛋白2可通過影響PI3K/AKT信號通路抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導HCC細胞凋亡。Liao等[13]研究顯示，阿帕替尼可能通過阻斷PI3K/AKT信號通路影響HCC細胞的放射敏感性。

ZNF可通過不同的功能性結構域、反式調(diào)控原件招募不同的染色體修飾因子及相互作用蛋白，在基因表達調(diào)控、細胞分化、胚胎發(fā)育、促進或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面具有重要作用[14]。ZNF在HCC組織和細胞中均存在異常表達，與HCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡和腫瘤復發(fā)等相關。He等[15]研究顯示，ZNF384通過特異性靶向細胞周期蛋白（cyclin）D1的啟動子區(qū)域并上調(diào)cyclin D1的表達來促進HCC細胞增殖，可能成為HCC的潛在治療靶點。Yi等[16]研究顯示，ZNF689在HCC組織中高表達，其陽性表達與腫瘤直徑、微血管侵犯、腫瘤包膜浸潤及不良預后顯著相關。

ZNF488基因位于染色體10q11.22，其編碼的蛋白分子量為38 kD，由340個氨基酸組成，是一種少突膠質(zhì)細胞特異性轉(zhuǎn)錄抑制因子。ZNF488扮演著癌基因的角色，可通過激活AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路促進胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，從而誘導胰腺癌細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。ZNF488表達與鼻咽癌患者的總生存期、局部區(qū)域無復發(fā)生存期、無遠處轉(zhuǎn)移生存期和無進展生存期相關，其機制為ZNF488通過影響膠原蛋白Ⅳ/黏附斑激酶/AKT信號通路增強細胞黏附，從而上調(diào)cyclin D1的表達，促進細胞周期進程，并通過不依賴胱天蛋白酶（caspase）的方式抑制細胞凋亡[18]。本研究采用CRISPR基因編輯技術構建了穩(wěn)定的ZNF488基因敲除HepG2細胞，流式細胞儀檢測結果顯示，ZNF488基因敲除的HepG2細胞在生長過程中阻滯在G2期的細胞比例增多，ZNF488基因敲除可阻滯HepG2細胞周期進展，同時促進細胞凋亡。CCK8法和Transwell小室實驗檢測結果顯示，敲除ZNF488可以抑制HepG2細胞增殖、遷移和侵襲。PI3K/AKT信號通路可調(diào)控細胞周期，增加相關蛋白的表達會改變細胞周期分布。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除ZNF488基因后，p-AKT、p-PI3K蛋白相對表達量均下降，表明敲除ZNF488基因可能阻斷PI3K/AKT信號通路，降低HepG2細胞的增殖能力，誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖、遷移和侵襲。敲除ZNF488對HCC的影響有可能是通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)的，但其具體調(diào)控機制還有待進一步深入研究。

綜上所述，本研究應用CRISPR基因編輯技術構建了穩(wěn)定的ZNF488基因敲除HepG2細胞，發(fā)現(xiàn)抑制ZNF488的表達可抑制HepG2細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡，其機制可能與阻斷PI3K/AKT信號通路有關，為HCC的靶向治療提供了新的靶點，同時也有助于評估靶向治療的效果。