劉倩穎 張 美

江蘇省南京市江寧醫(yī)院 211100

糖尿病腎病(DN)是機(jī)體長時(shí)間高糖狀態(tài)導(dǎo)致的蛋白尿以及腎小球?yàn)V過率進(jìn)行性降低，是糖尿病的常見并發(fā)癥和主要死亡原因之一，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[1]。臨床對DN的病因和發(fā)病機(jī)制認(rèn)識尚不完全，目前主要認(rèn)為與遺傳因素和糖代謝異常、腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變以及免疫炎癥因子等有關(guān)。相關(guān)研究表明，機(jī)體免疫平衡中的Th1/Th2細(xì)胞平衡可能影響患者糖尿病腎病發(fā)展進(jìn)程，Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞是由T輔助細(xì)胞(CD4+細(xì)胞)根據(jù)機(jī)體發(fā)生不同優(yōu)勢免疫應(yīng)答分泌的細(xì)胞因子不同分化而來，生理?xiàng)l件下,機(jī)體的Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞維持一定比例，從而保持人體免疫平衡，當(dāng)患者發(fā)生免疫異常時(shí)，CD4+細(xì)胞的分化偏向其中一方，Th1/Th2平衡發(fā)生變化[2]。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)PI3K和蛋白激酶B(PKB/AKT)已被證實(shí)是體內(nèi)關(guān)鍵的胰島素信號分子，PI3K-AKT信號通路能促進(jìn)胰島素刺激的葡萄糖攝取與儲存，在有胰島素刺激的情況下，可啟動(dòng)PI3K-AKT信號途徑，解除對糖原合酶(GS)的抑制，促進(jìn)糖原的合成[3]。因此，本文通過對比健康體檢者與DN患者血清中Th1/Th2細(xì)胞平衡的變化和血清中PI3K、AKT濃度差異，探究糖尿病腎病患者外周血中Th1/Th2變化及其與PI3K/AKT通路的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年9月—2021年9月我院治療的糖尿病腎病患者100例為觀察組，其中男48例，女52例，平均年齡(51.25±7.86)歲，體質(zhì)指數(shù)23.45±3.36。選取同期來我院體檢的78例健康者為對照組，其中男38例，女40例，平均年齡(51.84±7.43)歲，體質(zhì)指數(shù)23.18±3.42。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)糖尿病腎病的診斷參照中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會2014年制定的《糖尿病腎病防治專家共識》；(2)對本次研究內(nèi)容知情并簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他嚴(yán)重慢性疾病或惡性腫瘤者；(2)嚴(yán)重精神障礙或溝通障礙無法配合治療者；(3)合并自身免疫疾病或感染者；(4)合并心衰、酮癥酸中毒等嚴(yán)重并發(fā)癥者。

1.3 方法

1.3.1 Th1/Th2細(xì)胞水平測定：(1)測定原理：Th1細(xì)胞主要分泌γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-5、白細(xì)胞介素-10等，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。由于生理狀況下T細(xì)胞未受到刺激，所分泌的細(xì)胞因子非常少，可忽略不計(jì)，而IFN-γ是Th1分泌的最特異的細(xì)胞因子，IL-4是Th2分泌的最特異的細(xì)胞因子。因此在測定Th1/Th2細(xì)胞水平時(shí)，可采用Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ與Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4的比值近似表達(dá)Th1/Th2比率。(2)具體步驟：①標(biāo)本采集：所有觀察對象均于早晨采集空腹靜脈血6ml，取3ml外周靜脈血于肝素鈉抗凝管，加入淋巴細(xì)胞分離液，離心(3 000r/min,10min)后，取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)懸液，稀釋PBMC懸液至1×107/ml，將稀釋后的PBMC加入細(xì)胞培養(yǎng)板，然后向培養(yǎng)板內(nèi)加入250×PMA/lonomycin和 250×Monensin/BFA，將其混合均勻后放入充滿5%濃度CO2恒定溫度37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。然后加入anti-CD3 FITC和anti-CD4 PERCP對PMBC表面抗原染色，采用 FIX&PERM Reagent A破膜，用anti-IFN-γAPC和anti-IL-4 PE做細(xì)胞內(nèi)因子染色，用同型IgG抗體對照，以流式細(xì)胞儀(購自美國貝克曼公司，型號：FC500A)檢測INF-γ的 CD4細(xì)胞、IL-4的CD4細(xì)胞所占百分比，近似代表Th1、Th2所占百分比。②取3ml外周血置于促凝管中，離心(3 000r/min,10min)后，取上清與無菌EP管中，使用IL-4和 IFN-γ 的 ELISA 試劑盒(杭州賽基生物科技公司成品試劑盒)檢測細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的外周血表達(dá)水平，具體步驟按照說明書進(jìn)行。

1.3.2 PI3K/Akt通路測定：(1)提取總RNA：所有受試者均于清晨抽取空腹靜脈血2ml，3h內(nèi)完成總RNA提取,后凍存于-80℃冰箱中。采用RNA提取試劑盒(吸附柱法)提取總RNA，采用紫外—可見分光光度法測定Z總RNA的濃度和純度，應(yīng)用瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳(180mV,5min)，判定RNA完整性，取400ng總RNA待用。(2)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)與相對定量評估：采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Oligod(T)逆轉(zhuǎn)錄RNA，反應(yīng)條件為42℃水浴20min+95℃水浴3min，反應(yīng)結(jié)束后將其生成物保存與-80℃，等待檢測。用QuantiFast ProbeAssays、QuantiFast ProbePCRKit(均購自QiagenCo,Gemany)和ABIPrism7500型PCR儀(ABI公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)。探針測定AKT1引物、HsAKT1PQF1QuantiFast與PI3KCB引物、HsPI3KCBQF1QuantiFast,應(yīng)用GADPH引物及探針為內(nèi)部對照，PCR反應(yīng)體系：總體積25μl,反應(yīng)條件為40個(gè)循環(huán)，94℃預(yù)變性 5min,94℃變性30s，65℃退火30s。均平行測定3次后獲取平均Ct值,按Ct值對斜率及截距進(jìn)行計(jì)算,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對PI3KmRNA及AKTmRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.4 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) (1)對比兩組外周血中IFN-γ及IL-4的表達(dá)水平；(2)對比分析兩組患者外周血中 Th1/Th2 細(xì)胞比例變化；(3)對比分析兩組外周血中PI3K mRNA、AKT mRNA的表達(dá)水平；(4)比較糖尿病腎病患者外周血IFN-γ、IL-4水平與PI3K mRNA、AKT mRNA的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血IFN-γ、IL-4水平比較 觀察組的IFN-γ水平均較對照組高，IL-4水平較對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組外周血IFN-γ、IL-4水平比較

2.2 兩組外周血中Th1/Th2細(xì)胞比例比較 觀察組外周血Th1細(xì)胞多于對照組，Th2細(xì)胞對照組低，Th1/Th2較對照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者外周血中Th1/Th2細(xì)胞比例比較

2.3 兩組外周血PI3K mRNA、AKT mRNA比較 觀察組外周血中PI3K mRNA、AKT mRNA水平均高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組外周血PI3K mRNA、ATK mRNA表達(dá)水平比較

2.4 IFN-γ、IL-4水平及Th1/Th2值與PI3K mRNA、AKT mRNA的相關(guān)性 外周血IFN-γ水平與PI3K mRNA、AKT mRNA均呈正相關(guān)(r=0.131、0.032，P<0.05)，外周血IL-4水平與PI3K mRNA、AKT mRNA均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.132、-0.212，P<0.05)。

3 討論

免疫因素是糖尿病及其并發(fā)癥的一個(gè)重要因素，天然免疫中補(bǔ)體系統(tǒng)和模式識別受體之間關(guān)系密切、相互作用機(jī)制繁雜，在糖尿病腎病的發(fā)病過程中有關(guān)鍵性作用[4]。T細(xì)胞根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子和功能不同，在外界因素的刺激下，分化為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，Th1/Th2細(xì)胞平衡是維持機(jī)體健康的重要免疫機(jī)制，兩種細(xì)胞互為抑制，處于動(dòng)態(tài)平衡中。研究表明，Th1/Th2細(xì)胞平衡與糖尿病腎病關(guān)系密切，Th1細(xì)胞可促進(jìn)糖尿病的發(fā)生，而Th2細(xì)胞對糖尿病有保護(hù)作用[5]。PI3K/AKT信號通路作為調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)運(yùn)和生存的重要通路，可以從整體上降低細(xì)胞的生長阻礙和細(xì)胞凋亡，并提高細(xì)胞的存活能力和繁殖能力[6]。有研究證實(shí)PI3K/AKT信號通路是胰島素的主要信號通路，胰島素刺激引起PI3K信號傳導(dǎo)途徑的作用下降，使用PI3K/AKT 信號通路抑制劑能夠引起胰島素抵抗[7]。

本文通過對比分析兩組患者外周血IFN-γ、IL-4水平和Th1/Th2變化,結(jié)果顯示觀察組患者Th1細(xì)胞占比及Th1/Th2均較對照組高，而Th2細(xì)胞占比較對照組低。提示在糖尿病腎病患者中Th1細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)過程，體內(nèi)IFN-γ等炎癥因子水平升高，促進(jìn)糖尿病腎損傷的發(fā)生，而IL-4水平在這一過程中有降低。在DN患者腎損傷過程中，細(xì)胞免疫反應(yīng)較體液免疫反應(yīng)更占據(jù)優(yōu)勢，IFN-γ升高促進(jìn)B淋巴細(xì)胞活化，導(dǎo)致NK細(xì)胞過度激活進(jìn)而過度損傷胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致糖尿病腎病。比較兩組外周血PI3K mRNA、AKT mRNA水平，結(jié)果表明觀察組外周血中PI3K mRNA、AKT mRNA水平均高于對照組，將其與外周血IFN-γ、IL-4細(xì)胞水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明外周血INF-γ水平與PI3K mRNA、AKT mRNA均呈正相關(guān)，外周血IL-4水平與PI3K mRNA、AKT mRNA均呈負(fù)相關(guān)。糖尿病腎病患者外周血中PI3K mRNA和AKT mRNA水平均高于健康對照組，提示PI3K/AKT信號通路的表達(dá)與糖尿病腎病進(jìn)展相關(guān)。這與祝再然等[8]的研究結(jié)論一致，認(rèn)為PI3K通過激活其下游的重要靶蛋白AKT進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游信號分子參多種生理病理活動(dòng)，在糖代謝過程中，胰島素可激活胰島β細(xì)胞內(nèi)蛋白酪氨酸激酶(PTK)，進(jìn)而通過胰島素受體底物蛋白(IRS)激活PI3K，而PI3K可以激活其下游信號分子AKT,激活A(yù)KT后通過將細(xì)胞內(nèi)葡萄糖運(yùn)載體囊泡轉(zhuǎn)移固定到細(xì)胞膜從而發(fā)揮降低血糖的作用。而Th1細(xì)胞因子(IFN-γ)通過促進(jìn)PI3K/AKT信號通路的表達(dá)來促進(jìn)糖尿病腎病進(jìn)展。而Th2細(xì)胞因子(IL-4)與PI3K mRNA和AKT mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，提示Th2細(xì)胞因子可能通過抑制PI3K/AKT信號通路來預(yù)防或延緩糖尿病患者腎損傷的發(fā)生。

綜上所述，糖尿病腎病患者外周血Th1細(xì)胞水平升高，而Th2細(xì)胞水平下降，且Th1/Th2水平升高可能過度激活PI3K/AKT信號通路，導(dǎo)致糖尿病腎病。