蘇 倩 鄭 宏 王 娟 王棟洋，2

1 湘南學院臨床學院，湖南省郴州市 423000； 2 湘南學院附屬醫(yī)院

MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)結(jié)合降解靶基因mRNA或者阻礙其翻譯。近年來miRNA在人類疾病中的作用不斷被揭示，尤其是惡性腫瘤[1]。miR-200c-3p是miR-200家族的重要成員，現(xiàn)有文獻資料多支持它與腫瘤密切相關(guān)[2]。研究顯示, miR-200c-3p在腎癌[3]、甲狀腺癌[4]、胃癌[5]等腫瘤中表達異常，并參與腫瘤進展，有望成為這些腫瘤的治療靶點及預后生物標志物。然而，目前對miR-200c-3p的研究尚淺，涉及的生物學過程和信號通路不完全清楚，針對其功能和作用機制研究具有重大現(xiàn)實意義。因此，本研究通過生物信息學方法對miR-200c-3p的靶基因集合進行功能注釋和信號通路分析，為后續(xù)驗證靶基因及其作用機制研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 保守性分析 miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)是一個可供檢索的已發(fā)表的miRNA序列和注釋數(shù)據(jù)庫。從數(shù)據(jù)庫中獲取miR-200c-3p的染色體定位、堿基序列等信息，進行保守性分析。

1.2 hsa-miR-200c-3p在組織器官和疾病中的表達分析 miRGator 3.0數(shù)據(jù)庫(http://www.mirgator.kobic.re.kr/)是深度測序時代的microRNA門戶，包括microRNA多樣性、表達譜、靶關(guān)系和各種支持工具，收集了73個人類樣本的深度測序數(shù)據(jù)集，包含41億條短序列和25億條匹配過的序列。通過miRGator v3.0數(shù)據(jù)庫，獲取hsa-miR-200c-3p在不同組織器官和疾病中的表達數(shù)據(jù)。

1.3 預測靶基因 選擇miRDB(http://mirdb.org)和TargetScan 7.2 (http://www.targetscan.org/ vert _72/)在線軟件預測hsa-miR-200c-3p靶基因，取其交集。從miRTarBase數(shù)據(jù)庫(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)提取已通過熒光素酶報告基因檢測、Western blot和qPCR等強有力證據(jù)驗證的靶基因。將預測的靶基因數(shù)據(jù)交集與實驗已證實的靶基因合并，最終確定的靶基因集合用于后續(xù)分析。

1.4 GO和KEGG通路富集分析 利用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對靶基因集合進行功能富集分析和信號轉(zhuǎn)導通路富集分析。借助數(shù)據(jù)庫軟件附帶的Fisher Exact Test計算P值，以P<0.05 為顯著性閾值得到具有統(tǒng)計學意義的生物學過程和信號轉(zhuǎn)導通路。

2 結(jié)果

2.1 miR-200c-3p的定位及保守性分析 miRbase數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果顯示，miR-200c-3p位于人染色體12p13.31區(qū)域。人類miR-200c-3p與褐家鼠、家鼠、家兔、獼猴、斑馬魚等10個物種的miR-200c-3p在堿基序列“AAUACUGCCGGGUAAUGAUG”區(qū)域具有高度相似性，表明miR-200c-3p在不同物種間高度保守。見表1。

表1 不同物種miR-200c-3p的成熟序列

2.2 hsa-miR-200c-3p的表達情況 結(jié)果顯示hsa-miR-200c-3p在不同器官中存在表達差異，其中在膀胱、胃腸道、腦、四肢、肺、前列腺等組織中表達豐度較高(見圖1)。與正常組織相比，hsa-miR-200c-3p在膀胱癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等疾病表達水平較高(見圖2)。

圖1 hsa-miR-200c-3p在器官中的表達情況

2.3 靶基因的篩選 miRDB和Targetscan 7.2軟件預測hsa-miR-200c-3p靶基因分別為1 244個和44個，取其交集共獲得27個基因。結(jié)合miRTarBase數(shù)據(jù)庫查詢的已通過雙熒光素酶報告基因、Western blot、qPCR方法中至少經(jīng)兩種實驗證實的靶基因共53個，其中有1個靶基因(KDR)與上述預測靶基因重合，最終獲得79個無重復候選靶基因，用于后續(xù)分析。

圖2 hsa-miR-200c-3p在疾病中的表達情況

2.4 GO和KEGG通路富集分析 GO和KEGG通路富集分析顯示，這些靶基因主要參與了細胞形態(tài)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因表達調(diào)控、細胞內(nèi)信號傳導、細胞增殖、血管生成、血管內(nèi)皮細胞遷移調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學過程(見表2) ，涉及PI3K-Akt、Ras、Rap1、黏著斑、MAPK、VEGF等信號通路，以及前列腺癌、小細胞肺癌、胰腺癌、腎癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等疾病相關(guān)通路(見表3)。

表2 hsa-miR-200c-3p 靶基因的 GO 功能分析(生物學過程)

3 討論

miRNA作為轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控因子，參與人類多種生理病理過程，包括腫瘤的發(fā)生、分化、增殖、凋亡和侵襲，在惡性腫瘤中具有潛在的診斷、治療和預后價值[6]。近年來研究人員普遍關(guān)注miRNA異常表達與癌癥的關(guān)系，有報道稱miR-200c-3p參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究通過對多個物種miR-200c-3p堿基序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p在人、褐家鼠、家鼠及家兔等物種在基因位置上保守, 序列上也呈現(xiàn)出高度同源性。miR-200c-3p高度的保守性，表明它在生物體內(nèi)可能編碼一些重要蛋白。文獻資料證實miR-200c-3p在甲狀腺癌[4]、胃癌[5]、膀胱癌[8]、卵巢癌[2]等多種腫瘤中表達上調(diào)。miRGator數(shù)據(jù)庫查詢顯示，miR-200c-3p在膀胱、胃腸道、肺、前列腺、甲狀腺等器官表達豐度較高；與正常組織相比，在膀胱癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等表達水平較高。本研究發(fā)現(xiàn)與已知文獻資料基本一致，進一步證明了本實驗研究過程和分析的正確性與可靠性。

在實驗中利用靶基因預測軟件共獲得79個候選靶基因，GO功能和信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p靶基因主要參與細胞形態(tài)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄、基因表達、細胞增殖、血管生成、血管內(nèi)皮細胞遷移調(diào)節(jié)等生物學過程；miR-200c-3p存在于前列腺癌、小細胞肺癌、腎癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種癌癥相關(guān)信號通路中，提示miR-200c-3p與多種癌癥存在密切關(guān)聯(lián)。從生物信息學分析結(jié)果而言，miR-200c-3p在腫瘤形成、進展過程中扮演著重要角色。而現(xiàn)有的關(guān)于其調(diào)控作用的研究報道，亦證實了這一觀點。在甲狀腺癌中miR-200c-3p負向調(diào)節(jié)ATP2A2促進腫瘤進展[4]；miR-200c-3p下調(diào)后可抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[5]。在腎細胞癌中miR-200c-3p過表達后通過調(diào)控wnt/β-catenin信號通路靶向SOX2抑制細胞增殖、遷移與侵襲[3]。Li等[9]發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p在腎母細胞瘤呈低表達，靶向調(diào)節(jié)FRS2抑制細胞增殖、遷移和侵襲。文獻資料提示了miR-200c-3p可靶向調(diào)控一些關(guān)鍵基因從而影響腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為。

本研究靶基因預測結(jié)果顯示，miR-200c-3p可能調(diào)控 IKBKB、E2F3基因。IKBKB是組成IKK復合物重要的催化亞基之一，其對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活起到重要調(diào)控作用，此前已被證明對細胞凋亡、耐藥等有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)IKBKB基因可能參與了PI3K-Akt、Ras、mTOR、NF-κB多條信號通路及前列腺癌、小細胞肺癌、胰腺癌等癌癥相關(guān)通路，表明IKBKB與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。最近該領域的研究進展也揭示了IKBKB與癌癥生物學行為的發(fā)生相關(guān)。在腎癌中miR-21抑制PDCD4的表達，激活Akt-IKBKB軸，從而促進遷移和侵襲[10]。而IKBKB/NF-κB參與了雙酚A誘導的宮頸癌細胞遷移[11]；IKBKB過表達可恢復miR-503抑制的非小細胞肺癌的惡性特性[12]。文獻提示其與腫瘤關(guān)系密切，但miR-200c-3p是否直接靶向調(diào)控IKBKB發(fā)揮抑癌或促癌作用，有待進一步的科學實驗驗證。另外，E2F3作為一種轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)E2F3在乳腺癌中促進上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化、細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。在結(jié)腸癌中，E2F3的表達與腫瘤分期顯著相關(guān)，E2F3高表達的患者具有較低生存率[14]。在肺癌組織中E2F3亦呈高表達，E2F3過表達與抗凋亡因子Bcl-2的上調(diào)相關(guān)[15]。資料表明E2F3在惡性腫瘤中可能具有臨床意義，可作為判斷預后不良的潛在生物標志物。本研究通過生物信息學方法發(fā)現(xiàn)IKBKB、E2F3等可能是miR-200c-3p的潛在靶向調(diào)控基因，而miR-200c-3p可能通過調(diào)控這些重要基因影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。鑒于目前國內(nèi)外尚缺乏明確且直接的研究證據(jù)證實兩者為miR-200c-3p的靶向調(diào)控基因，需要后期補充實驗加以證實。

表3 hsa-miR-200c-3p 靶基因集合的KEGG通路富集分析結(jié)果

本研究從生物信息學角度證實了miR-200c-3p功能廣泛,可能通過調(diào)控IKBKB、E2F3等一些重要基因參與人類生命活動和疾病過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用不容忽視，為進一步研究其在腫瘤的作用和發(fā)生機制提供了有效的生物信息學基礎。