楊亞藍(lán)，宗上綱，王莉，王峰

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450052； 2.河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，河南 鄭州 450052)

免疫治療新時代的到來，極大地改變了腫瘤治療模式[1]。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)-T細(xì)胞作為新興的過繼性免疫治療策略，已成為近年來腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)[2-3]。血液中的T細(xì)胞經(jīng)過分離活化、基因修飾和改造、體外擴(kuò)增、體內(nèi)回輸?shù)纫幌盗羞^程，可識別特定腫瘤表面抗原并發(fā)揮靶細(xì)胞殺傷作用[3]。目前，CAR-T細(xì)胞治療B細(xì)胞白血病或淋巴瘤亞群，總體緩解率高且作用持久，這給腫瘤免疫治療帶來革命性的改變[4-5]。同時，CAR-T細(xì)胞免疫療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中的成功為實(shí)體瘤的治愈提供了新的希望，一系列CAR-T細(xì)胞的早期臨床試驗(yàn)在實(shí)體瘤中開展[6-9]。與血液系統(tǒng)疾病相比，選擇適當(dāng)?shù)哪[瘤特異性抗原、增加CAR-T細(xì)胞在腫瘤位點(diǎn)的歸巢、中和免疫抑制微環(huán)境、克服CAR-T細(xì)胞毒性是阻礙實(shí)體瘤中CAR-T細(xì)胞發(fā)揮療效的重要因素。本綜述回顧了CAR-T 細(xì)胞的研究進(jìn)展，指出了CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤治療中面臨的挑戰(zhàn)和新的策略，旨在為CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)提供新的思路。

1 CAR-T細(xì)胞的發(fā)展

CARs是基因工程受體，主要由細(xì)胞外抗原識別域(胞外域)、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域(內(nèi)域)共4部分組成[10]。胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域主要為靶抗原-抗體的單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)，由重鏈可變區(qū)(heavy chain variable，VH)和輕鏈可變區(qū)(light chain variable，VL)組成，是CAR-T細(xì)胞特異性識別靶細(xì)胞的“定位器”，通過引起主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)非依賴性T細(xì)胞活化[11]，發(fā)揮特異性殺傷作用。鉸鏈區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的“連接器”，有助于CARs表達(dá)和穩(wěn)定性的增強(qiáng)、CARs和抗原的相互識別、CAR-T激活的刺激信號的募集及免疫突觸形成。鉸鏈區(qū)的長度和組成差異是影響CARs的重要因素，最常用的鉸鏈區(qū)來自CD8、CD28、IgG1或IgG4的氨基酸序列?？缒そY(jié)構(gòu)域的主要功能是將CARs錨定在T細(xì)胞膜上，通常為CD3ζ、CD4、CD8α 或 CD28的跨膜區(qū)。胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域主要由刺激因子CD3ζ鏈組成，常與CD28、ICOS、OX40(CD134)和4-1BB (CD137)等共刺激分子結(jié)合[12-13]，是激活T細(xì)胞所必需的“信號器”，可介導(dǎo)細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞殺傷。

CAR-T細(xì)胞歷經(jīng)五代，其主要區(qū)別在于特定的共刺激分子不同[1-2]。90年代設(shè)計(jì)的第一代CAR-T細(xì)胞僅包含CD3ζ信號域，由于缺乏共刺激分子，T細(xì)胞活化的觸發(fā)和持久性極不穩(wěn)定，臨床研究顯示其療效有限或無效[14]。為克服這一缺點(diǎn)，第二代CAR-T細(xì)胞將CD3ζ與共刺激分子[CD28、4-1BB (CD137)、ICOS、OX40(CD134)等]串聯(lián)，從而使CAR-T細(xì)胞持續(xù)增殖，在多種實(shí)體瘤中展現(xiàn)更強(qiáng)的抗腫瘤活性[12-13,15-16]。CD28和4-1BB(CD137)為最常見的、美國食品藥品監(jiān)督管理局(U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的共刺激域，均與患者反應(yīng)率高相關(guān)[17]。為了更好地激活T細(xì)胞，第三代CAR-T細(xì)胞將2個共刺激分子與CD3ζ串聯(lián)，使細(xì)胞因子分泌增多，對癌細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)[18]。三代CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤中展現(xiàn)不同的療效[19-20]。通過編碼細(xì)胞因子的基因，第四代CAR-T細(xì)胞在激活時分泌大量炎癥細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-12[21]、IL-15和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子[22-23]等，以進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答并招募先天免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等)，從而對抗免疫抑制性腫瘤微環(huán)境?；蚣尤胱詺⒒蛘{(diào)控細(xì)胞衰竭，以提高CAR-T細(xì)胞的安全性和可控性[24]。有研究表明，四代CAR-T細(xì)胞在肝癌[25]、三陰性乳腺癌[26]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[27]等顯示出顯著的抗腫瘤活性。第五代CAR-T細(xì)胞也稱為“通用型”CAR-T細(xì)胞，利用基因編輯技術(shù)敲除健康供者T細(xì)胞上的T細(xì)胞抗原受體和Ⅰ型人類白細(xì)胞抗原基因，以降低免疫排斥反應(yīng)，避免移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)的發(fā)生[28-30]。在實(shí)體瘤模型中，第五代CARs通過基因改造增強(qiáng)了T細(xì)胞增殖、存活及抗腫瘤作用，但第五代CAR-T細(xì)胞的安全性和有效性有待研究[28]。

2 CAR-T細(xì)胞治療面臨的挑戰(zhàn)

2.1 CAR-T細(xì)胞靶抗原的選擇CARs通過識別并結(jié)合特定的腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)，進(jìn)而激活下游信號通路以引發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞殺傷[2,31]。目前正在研究實(shí)體瘤中的多個靶點(diǎn)用于CAR-T細(xì)胞治療，包括人表皮生長因子受體-2、癌胚抗原、唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂2、IL-13Rα、表皮生長因子受體、黏蛋白1和前列腺特異性膜抗原。由于大多數(shù)TAA在腫瘤和健康組織上均有表達(dá)，CAR-T細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時會破壞正常細(xì)胞，引起“靶向腫瘤外”毒性。同種異體CAR-T細(xì)胞的輸注甚至導(dǎo)致GVHD的發(fā)生。此外，與血液腫瘤相比，實(shí)體瘤具有獨(dú)特的抗原異質(zhì)性特點(diǎn)，CAR-T細(xì)胞優(yōu)先殺傷靶抗原高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，且治療后靶抗原下調(diào)和丟失，這種“脫靶效應(yīng)”不僅削弱了CAR-T療法的效果，而且使腫瘤細(xì)胞能順利逃避T細(xì)胞的免疫監(jiān)視，從而引起耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)[32]。因此，定位適當(dāng)和特定的靶抗原是實(shí)體瘤CAR-T細(xì)胞療法面臨的極大挑戰(zhàn)。

單抗原靶向CAR-T細(xì)胞易誘發(fā)耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)。在臨床前模型中，雙靶向或多靶向CAR-T細(xì)胞，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(HER2/IL13Rα2)、髓母細(xì)胞瘤(HER2/IL13Rα2/EphA2)，不僅可以改善抗腫瘤反應(yīng)，還可以減少抗原逃逸以防止復(fù)發(fā)，但其安全性仍需進(jìn)一步研究[33]。此外，將上調(diào)腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)、靶向腫瘤限制性翻譯后修飾作為創(chuàng)新策略，以增強(qiáng)特異性抗原識別，以期更有效地控制腫瘤生長。

2.2 CAR-T細(xì)胞歸巢不良CAR-T細(xì)胞的靶向運(yùn)輸和腫瘤浸潤能力是實(shí)體瘤中CAR-T細(xì)胞療效欠佳的重要原因[34]。腫瘤微環(huán)境中一系列屏障的形成阻礙了CAR-T細(xì)胞歸巢，包括物理屏障(基質(zhì)成分)、代謝屏障(氧化應(yīng)激、無氧糖酵解及乳酸堆積)及免疫屏障(可溶性抑制因子、免疫抑制性靶點(diǎn)及細(xì)胞)[34-35]。采用局部給藥的策略，避免了CAR-T細(xì)胞向疾病部位的運(yùn)輸，并限制了靶向外腫瘤毒性。臨床前模型已經(jīng)證明在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、惡性胸膜間皮瘤中局部CAR-T細(xì)胞治療具有卓越的效果，相應(yīng)的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行[36-37]。然而，這種方法受到其高技術(shù)復(fù)雜性的限制，且局限于單個腫瘤病變/寡轉(zhuǎn)移性疾病。

過表達(dá)CAR-T細(xì)胞中的趨化因子受體作為另一新策略，可促進(jìn)CAR-T細(xì)胞向高表達(dá)同源配體的腫瘤部位遷移，增強(qiáng)T細(xì)胞的持久性，并可招募宿主體內(nèi)的免疫細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞等)，從而顯著增強(qiáng)抗腫瘤功效[38-39]。這在胰腺癌、卵巢癌[38]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[39]和惡性間皮瘤[40]等的臨床前模型中被證實(shí)，其有效性及安全性有待進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證。此外，過表達(dá)調(diào)控基質(zhì)降解酶的基因、靶向成纖維細(xì)胞活化蛋白等策略，可通過調(diào)節(jié)物理屏障，來提高腫瘤穿透性，以便將治療效果擴(kuò)展到復(fù)雜的實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移灶[41-42]。

2.3 中和免疫抑制微環(huán)境CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的臨床效果受到免疫抑制性微環(huán)境的限制，例如缺氧、氧化應(yīng)激、腫瘤源性細(xì)胞因子抑制、免疫抑制性檢查點(diǎn)及細(xì)胞等[32,35]。既往研究表明，腫瘤細(xì)胞可釋放多種免疫抑制因子，包括血管內(nèi)皮生長因子、IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β 和前列腺素E2，激活抑制性免疫細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞)，從而形成腫瘤免疫抑制性微環(huán)境。通過基因工程敲除免疫檢查點(diǎn)(程序性死亡受體1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4、淋巴細(xì)胞激活基因3等)[29,43]、改造抑制性細(xì)胞因子受體[39]、調(diào)控代謝及凋亡相關(guān)基因[41]等，以逆轉(zhuǎn)CAR-T細(xì)胞的耗竭表型，改善實(shí)體瘤中的T細(xì)胞浸潤和功能。在腎細(xì)胞癌、黑色素瘤等實(shí)體瘤相關(guān)的臨床前研究中，敲除免疫檢查點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞抗腫瘤活性顯著提高，相應(yīng)的臨床試驗(yàn)在食管癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌、轉(zhuǎn)移性腎癌、黑色素瘤、乳腺癌等實(shí)體瘤中開展[44]。此外，CAR-T細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)阻斷劑聯(lián)合療法被認(rèn)為是有期望的策略。

2.4 克服CAR-T細(xì)胞相關(guān)毒性盡管CAR-T細(xì)胞在某些類型的癌癥患者中取得了持久的臨床反應(yīng)，特別是表達(dá)CD19的難治性和復(fù)發(fā)性B細(xì)胞惡性腫瘤，但其可能會發(fā)生與誘導(dǎo)強(qiáng)大的免疫效應(yīng)反應(yīng)直接相關(guān)的毒性[45]。最常觀察到的免疫介導(dǎo)的毒性是細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)和免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)的神經(jīng)毒性綜合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS)。CRS與超生理細(xì)胞因子產(chǎn)生和大量體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增有關(guān)，可能導(dǎo)致發(fā)燒、低血壓、缺氧、惡心、疲勞、多器官衰竭，甚至死亡。早期識別和管理CRS的癥狀和體征，可以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)大多數(shù)患者的器官功能障礙。ICANS的特征是腦脊液細(xì)胞因子水平升高和血腦屏障破壞，通常表現(xiàn)為中毒性腦病、癲癇發(fā)作、運(yùn)動無力、腦水腫和昏迷。ICANS通常發(fā)生在CRS癥狀消退后，在大多數(shù)無永久性神經(jīng)功能缺損的患者中是可逆的。設(shè)計(jì)新的CARs結(jié)構(gòu)以最大限度地降低引發(fā)CRS和ICANS的風(fēng)險(xiǎn)，同時優(yōu)化腫瘤抗原的識別和有效的T細(xì)胞信號傳導(dǎo)。熟練掌握CRS和ICANS的癥狀和體征，是早期識別和管理這些并發(fā)癥的可靠前提。

3 以CAR-T細(xì)胞治療為主導(dǎo)的綜合治療的前景

研究表明，CAR-T細(xì)胞單一療法對實(shí)體瘤的療效有限。CAR-T細(xì)胞聯(lián)合其他治療的綜合性治療策略，可能作為實(shí)體瘤治療的可發(fā)展新策略[46]。目前聯(lián)合療法研究主要是在臨床前環(huán)境中。

3.1 聯(lián)合放療放射治療可誘導(dǎo)腫瘤壞死和細(xì)胞凋亡。研究表明，放療可能是通過增加靶抗原表達(dá)、CAR-T細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子/趨化因子表達(dá)，以及通過增強(qiáng)內(nèi)源性靶抗原特異性免疫以促進(jìn)更持久的反應(yīng)，間接提高CAR-T細(xì)胞的功效[47-48]。此外，放射治療可能通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)顯著增加，影響腫瘤血管正?；?，從而促進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的歸巢和遷移[48]。

3.2 聯(lián)合化療化療和CAR-T細(xì)胞聯(lián)合治療具有一定的抗腫瘤協(xié)同作用。臨床前研究顯示，低劑量化療給藥不僅能減輕腫瘤負(fù)荷、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對免疫治療的敏感性，而且具有免疫調(diào)節(jié)作用，其細(xì)胞毒性作用促進(jìn)了腫瘤抗原的識別和呈遞，這有利于中和免疫抑制性細(xì)胞，延長CAR-T細(xì)胞的持久性[49-50]。

3.3 聯(lián)合靶向治療或表觀遺傳抑制劑抗血管生成劑和檢查點(diǎn)抑制劑的組合在多種實(shí)體瘤類型的許多臨床試驗(yàn)中提供了更強(qiáng)大的治療選擇[51]。大量的臨床前和臨床證據(jù)表明抗血管生成在克服免疫治療耐藥性方面起著關(guān)鍵作用。臨床前研究表明，CAR-T細(xì)胞與抗血管生成療法聯(lián)合使用時，可以通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附分子使腫瘤血管正?；纳芓細(xì)胞功能障礙，從而增強(qiáng)T細(xì)胞歸巢和殺傷作用[52]。另一臨床前研究表明，靶向CDK7的小分子抑制劑和EGFR CAR-T細(xì)胞的聯(lián)合治療可抑制三陰性乳腺癌模型中的免疫耐藥、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[53]。

3.4 聯(lián)合其他免疫治療T細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)受體的獲得性表達(dá)是介導(dǎo)T細(xì)胞衰竭的重要機(jī)制。研究表明，添加抗程序性死亡受體1單克隆抗體[52,54]或能夠分泌抗程序性死亡受體-配體1的CAR-T細(xì)胞[55]可以阻斷受體的抑制作用，減少CAR-T細(xì)胞的衰竭，從而提高其清除腫瘤的療效和持久性。同樣地，抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4抗體也可增加T細(xì)胞活性，改善免疫功能活性[43]。

4 挑戰(zhàn)與展望

CAR-T細(xì)胞療法極大地改變了當(dāng)前腫瘤免疫治療的模式[1-2,31]。盡管CAR-T細(xì)胞療法正在被廣泛研究并在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了極大的成功，但其在實(shí)體瘤中的安全性和有效性仍不清楚[9]。這與實(shí)體瘤中缺乏腫瘤特異性抗原、低水平CAR-T細(xì)胞浸潤、抑制性腫瘤微環(huán)境及CAR-T細(xì)胞的毒性等密切相關(guān)[10,32,34]。目前許多研究嘗試通過選擇不同靶抗原、聯(lián)合共刺激分子、調(diào)節(jié)促炎性或抑制性細(xì)胞因子或阻斷免疫檢查點(diǎn)等，改善CAR-T細(xì)胞的靶細(xì)胞殺傷活性，延長其持久性和穩(wěn)定性，促進(jìn)免疫細(xì)胞歸巢，從而提高對腫瘤的清除功效。盡管存在挑戰(zhàn)，與放射療法、化學(xué)療法、靶向療法或其他免疫療法的聯(lián)合療法新策略仍在不斷發(fā)展[43,46-47,51,54]，并可能為未來更有效和更安全的治療提供方向。