黃欣媛，范紅波

(1.湖北工程學(xué)院 湖北省植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖北 孝感 432000；2.湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，湖北 孝感 432000)

提取自豌豆種子中的小分子多肽PA1b(Pea Albumin 1 Subunit b，豌豆白蛋白1b)[1]具有顯著的昆蟲毒性，能殺滅一些蚜蟲和糧食儲(chǔ)藏中的主要害蟲象鼻蟲，很有希望開發(fā)成新型生物殺蟲劑。PA1b在其他豆科植物中也廣泛分布，均具有高度緊縮的三維結(jié)構(gòu)，構(gòu)象非常穩(wěn)定，不被殺菌劑變性，也耐受胃酸降解，是目前已知的少數(shù)幾種口服活性的昆蟲毒性肽之一。此外，PA1b還表現(xiàn)出激素樣生理活性，參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育，在哺乳動(dòng)物中還能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，是一種重要的多功能生物活性肽。

1 PA1b的結(jié)構(gòu)及其生物多樣性

1.1 PA1b的結(jié)構(gòu)

PA1b由37個(gè)氨基酸殘基組成，分子內(nèi)第3、7、15、20、22和32位均為半胱氨酸，形成三對(duì)二硫鍵(圖1)。這些二硫鍵的三維排布是典型的抑制胱氨酸結(jié)(cystine knot inhibitor, ICK)結(jié)構(gòu)模型(圖2)，這一結(jié)構(gòu)賦予PA1b高度的穩(wěn)定性，在煮沸、有機(jī)溶劑(如：甲醇、戊烷、乙醚乙酸酯、丙酮、15%三氯乙酸水溶液等)提取后仍有活性，可以耐受蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K)、昆蟲腸道提取物或反芻動(dòng)物瘤胃的消化降解作用[2-5]，也使得PA1b的分離純化程序相對(duì)簡(jiǎn)單，可以從豌豆粉中經(jīng)溶劑萃取和經(jīng)典反相HPLC完成[6]。

圖1 PA1基因的結(jié)構(gòu)和PA1b的一級(jí)結(jié)構(gòu)

圖2 PA1b的三維結(jié)構(gòu)

1.2 PA1b的編碼基因——PA1基因

在豌豆中，PA1b由PA1(pea albumin 1)基因編碼[1]。PA1具有兩個(gè)外顯子，由一段位于信號(hào)肽編碼序列內(nèi)的較短的內(nèi)含子分隔開(圖1)。PA1基因最初轉(zhuǎn)錄和翻譯為前原蛋白PA1(130aa，分子量13.9kDa)，通過信號(hào)肽(26aa，2.7kDa)靶向運(yùn)送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。信號(hào)肽裂解后產(chǎn)生的原蛋白(104aa，11.2kDa)再被引導(dǎo)至豌豆種子蛋白質(zhì)儲(chǔ)存體中進(jìn)行內(nèi)源性蛋白裂解，切除兩個(gè)前肽片段后最終產(chǎn)生兩個(gè)成熟形式的多肽，即PA1a(53aa，6kDa)和PA1b(37aa，3.8kDa)。

PA1基因在豌豆種子早期萌發(fā)中很少或不轉(zhuǎn)錄，但在豌豆生長(zhǎng)發(fā)育成熟過程中轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加達(dá)到最大值(開花后20 ～ 22天)，然后急劇下降[1,4]。窄葉羽扇豆中的PA1b樣基因也主要在萌發(fā)的種子中存在，種子發(fā)芽?jī)商旌缶蜋z測(cè)不到[7]，這些研究表明PA1基因的表達(dá)在豆科種子萌發(fā)和生長(zhǎng)過程中具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臅r(shí)空調(diào)節(jié)機(jī)制。然而目前但對(duì)其表達(dá)調(diào)控的機(jī)理知之甚少，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的上游順式作用元件尚未鑒定。

1.3 PA1b的同源異構(gòu)體

PA1b屬于多基因家族，具有多種同源異構(gòu)體，因而可以統(tǒng)稱為PA1b蛋白家族。迄今為止，在豌豆中已發(fā)現(xiàn)9個(gè)同源異構(gòu)體[8-10]，它們絕大多數(shù)都具有殺蟲活性[9]。在黃豆、綠豆、蠶豆、菜豆、小豆、洋刀豆、扁豆、羽扇豆、黃芪等其他豆科植物中也發(fā)現(xiàn)了多種PA1b的同源異構(gòu)體[11-12](表1)，這些同源蛋白質(zhì)雖然有其他不同的命名，如leginsulin(豆類胰島素)[13]、aglycin(胰安肽)[14]等，但是它們之間氨基酸序列相似性都在60%以上，均為36 ～ 39個(gè)氨基酸殘基的小肽，具有保守的ICK結(jié)構(gòu)模型。這種結(jié)構(gòu)模型在植物、真菌、海洋軟體動(dòng)物、蜘蛛中廣泛存在，這類多肽往往具有多種生物活性，如離子通道抑制劑、蛋白酶抑制劑、抗微生物肽等。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)PA1b及其同源異構(gòu)體僅存在于豆科植物中，提示PA1b家族在豆科植物進(jìn)化中的重要性，尤其是其顯著的抗蟲活性，是豆科種子抵御蟲害的重要組分[15]。

表1 豆科植物中部分PA1b同源異構(gòu)體序列對(duì)比

2 PA1b的生理功能

PA1b對(duì)昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物表現(xiàn)出不同的生理功能。它可能通過和特異性受體結(jié)合來發(fā)揮作用，但是在昆蟲、植物以及動(dòng)物中的受體不一樣，因而有不同的作用機(jī)制。

2.1 對(duì)昆蟲的作用

PA1b對(duì)谷物象鼻蟲、蚜蟲具有顯著的殺傷力，尤其是能強(qiáng)力殺滅尖音庫蚊、伊蚊等傳染性病毒載體，而對(duì)蜜蜂和赤眼蜂等農(nóng)業(yè)益蟲沒有毒害作用，使得PA1b成為一種很有潛力能大規(guī)模應(yīng)用的新型生物殺蟲劑[16]。總的來說PA1b殺蟲譜系為鞘翅目昆蟲，鱗翅目對(duì)此肽不敏感。然而，體外培養(yǎng)的Sf9昆蟲細(xì)胞(來源于草地夜蛾)對(duì)低劑量的PA1b敏感，提示草地夜蛾有其他機(jī)制來抵消PA1b的毒性作用[17]。

由于昆蟲主要通過消化作用吸收豆類食物中的PA1b，因而尋找PA1b在昆蟲腸道中的受體是揭示PA1b昆蟲毒作用機(jī)制的關(guān)鍵。某些PA1b不敏感昆蟲如甘藍(lán)夜蛾的腸道提取物不能降解PA1b，PA1b敏感的象鼻蟲也是如此，因此昆蟲對(duì)PA1b的耐受性差異與其腸道對(duì)PA1b降解吸收的差別無關(guān)[2]。Gressent等[18]在象鼻蟲腸細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)了PA1b的一個(gè)高親和力受體，該受體為PA1b敏感的象鼻蟲品系所特有，耐藥品系中未檢測(cè)到，說明這一結(jié)合位點(diǎn)是PA1b昆蟲毒作用的分子靶標(biāo)。后來鑒定出該受體為V型ATP酶(V-ATPase)[19]。昆蟲V-ATPase由14個(gè)亞基組成兩個(gè)復(fù)合物，嵌入膜上的復(fù)合物V0中c亞基圍成環(huán)形成質(zhì)子通道；胞質(zhì)側(cè)復(fù)合物V1則具有ATP酶活性，利用跨膜的質(zhì)子電化學(xué)梯度推動(dòng)ATP的合成[20]。電生理研究表明PA1b能抑制Sf9細(xì)胞膜上的V-ATPase，阻礙其質(zhì)子泵功能，使細(xì)胞膜去極化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PA1b結(jié)合于V-ATPase的V0復(fù)合物，進(jìn)而抑制全酶活性，是V-ATPase的首個(gè)多肽類抑制劑[19]，和V-ATPase抑制劑巴弗洛霉素具有同樣的作用效果。該研究組接著[21]又利用電子顯微鏡技術(shù)揭示出PA1b和V-ATPase的具體結(jié)合位點(diǎn)涉及V0的c亞基環(huán)和e亞基，PA1b結(jié)合后將c亞基環(huán)"轉(zhuǎn)子"鎖定到靜態(tài)亞基e上，從而抑制了質(zhì)子泵的工作。c亞基突變導(dǎo)致象鼻蟲對(duì)PA1b不再敏感。在昆蟲消化道中，V-ATPase活性是昆蟲吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所必需能量的主要來源，PA1b的昆蟲毒性作用的機(jī)制在于抑制昆蟲腸道中V-ATPase活性，從而妨礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收[22]。另一方面，PA1b昆蟲毒作用的機(jī)理還在于PA1b和昆蟲腸細(xì)胞膜上的受體V-ATPase相互作用后，激活中腸細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性，觸發(fā)了中腸細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致昆蟲死亡[23]。

為研究PA1b氨基酸殘基對(duì)其結(jié)構(gòu)和殺蟲活性的影響，Da Silva等[24]化學(xué)合成了PA1b的13個(gè)突變體，每個(gè)突變體均有一個(gè)氨基酸殘基被替換成Ala(即丙氨酸突變掃描)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA1b的三維結(jié)構(gòu)幾乎沒有受到這些突變的影響，所有突變體和天然PA1b一樣都能抵抗蛋白酶降解，凸顯了PA1b分子結(jié)構(gòu)中ICK模體的穩(wěn)定性。特別的是，PA1b和受體V-ATPase結(jié)合以及殺象鼻蟲活性依賴于Phe-10，Arg-21，Ile-23和Leu-27這幾個(gè)關(guān)鍵殘基，它們分布在PA1b的一個(gè)側(cè)面上[23-24]。

Eyraud等[25]構(gòu)建了一種特殊的PA1基因載體，能夠表出達(dá)出豌豆種子中存在的PA1b的6種同源異構(gòu)體形式。殺蟲試驗(yàn)表明，5種具有相似的殺蟲活力，一種沒有殺蟲活性，該無活性同源異構(gòu)體和其他同源異構(gòu)體結(jié)構(gòu)區(qū)別很大，其親水性側(cè)面變?yōu)槭杷?，因而整個(gè)分子缺乏兩親性，說明PA1b的兩親性質(zhì)是殺蟲活性必需的[25]。

2.2 對(duì)植物的作用

Leginsulin是PA1b在黃豆中的同源異構(gòu)體[13]，兩者序列同源性近65%，三維結(jié)構(gòu)相似性超過80%，下文合稱leginsulin/PA1b。leginsulin/PA1b在黃豆中的受體是一種43kDa蛋白[26-27]，屬于堿性7S球蛋白(basic 7S globulin, Bg7S)，能調(diào)控細(xì)胞增殖和分化[28]。在胡蘿卜細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加leginsulin/PA1b，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，刺激愈傷組織再分化，對(duì)照組只觀察到愈傷組織增殖，未見器官分化，說明leginsulin/PA1b與植物生長(zhǎng)和分化的調(diào)控有關(guān)[29]。將leginsulin/PA1b基因轉(zhuǎn)入胡蘿愈傷組織中進(jìn)行表達(dá)，相比對(duì)照組，轉(zhuǎn)基因的愈傷組織在分化早期生長(zhǎng)更迅速，leginsulin基因轉(zhuǎn)入車軸草中也觀察到類似現(xiàn)象[29]。胡蘿卜中也含有l(wèi)eginsulin/PA1b的受體43kDa蛋白，因此推測(cè)leginsulin/PA1b是一種新型植物多肽激素，通過和43kDa蛋白結(jié)合并使其磷酸化而激活其酪氨酸激酶活性，從而激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與調(diào)控植物細(xì)胞增殖與分化。另外，趙燕英等[4]用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法檢測(cè)了PA1b在豌豆種子萌發(fā)過程中的含量變化，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)芽時(shí)間增加，PA1b含量逐漸減少，表明PA1b可能參與豌豆發(fā)芽過程，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起調(diào)控作用。

Hanada等[27]利用丙氨酸突變掃描分析了19個(gè)leginsulin/PA1b突變體，發(fā)現(xiàn)對(duì)leginsulin/PA1b與43kDa蛋白結(jié)合有影響的氨基酸殘基有13個(gè)，其中能夠顯著干擾兩者結(jié)合的是C端的幾個(gè)芳香族氨基酸和疏水性氨基酸殘基，最關(guān)鍵的是Val-29和Phe-31。盡管leginsulin和PA1b的三維結(jié)構(gòu)高度相似，涉及到和各自受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基卻是不同的，在空間上也位于分子上相反的側(cè)面，使得兩者在植物和昆蟲中的受體結(jié)合模式不同，因而具有不同的活性[24]。

2.3 對(duì)哺乳動(dòng)物的作用

PA1b具有抗癌活性。體外實(shí)驗(yàn)表明從發(fā)芽的黃豆中提取的leginsulin/PA1b能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，用該提取物飼喂接種了宮頸癌細(xì)胞的裸鼠，腫瘤生長(zhǎng)幾乎完全被抑制(腫瘤體積減少92%以上)[30]。未發(fā)芽黃豆的提取物效果次之，可能是由于發(fā)芽激活了這一活性肽的產(chǎn)生[30]，與上文所述leginsulin/PA1b在豆類種子萌發(fā)時(shí)含量最高的現(xiàn)象相符合。

PA1b還能調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的葡萄糖代謝和胰島素感受性，有望開發(fā)成口服的糖尿病防治藥物。外源添加PA1b能明顯延長(zhǎng)原代大鼠胰腺β細(xì)胞存活時(shí)間，并能調(diào)節(jié)其胰島素分泌水平[6]。小鼠皮下注射Aglycin(從豬腸中分離純化而來，和PA1b氨基酸序列完全相同，兩者為同一蛋白。推測(cè)Aglycin源于食物中的PA1b被豬腸道消化吸收[31]，下文中Vglycin也是Aglycin的同源異構(gòu)體，兩者僅1、2、31號(hào)氨基酸有區(qū)別)，能提升血糖濃度[31]。利用表面等離子共振(SPR)技術(shù)和肽指紋圖譜分析，鑒定出Aglycin/PA1b在小鼠胰腺中的一個(gè)與糖脂代謝相關(guān)的結(jié)合蛋白——電壓依賴陰離子選擇性通道1(voltage dependant anion-selective channel-1，VDAC-1)[31-32]。進(jìn)一步的電生理研究表明PA1b使大鼠胰腺β細(xì)胞膜去極化，打開膜上的L型鈣離子通道，使細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流從而提升胞內(nèi)鈣離子濃度，促進(jìn)β細(xì)胞的分泌活動(dòng)[33]。由于在植物中l(wèi)eginsulin/PA1b可與胰島素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體堿性7S球蛋白[28]，因而推測(cè)PA1b有可能結(jié)合到哺乳動(dòng)物的胰島素受體上。然而PA1b調(diào)節(jié)血糖的作用是否通過與VDAC-1、L型鈣離子通道或胰島素受體結(jié)合還在進(jìn)一步研究中。

為研究PA1b在糖尿病中的作用，對(duì)鏈脲霉素(STZ)加高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠[14]和大鼠[34]模型給以4周的日常Aglycin/PA1b灌胃，結(jié)果有效降低了血糖水平，改善了口服葡萄糖耐受性。進(jìn)一步分析模型鼠體內(nèi)胰島素相關(guān)信號(hào)分子的變化，發(fā)現(xiàn)Aglycin/PA1b的作用在于維持胰島素受體(IR)和胰島素受體底物1(IRS1)的mRNA和蛋白質(zhì)的正常表達(dá)水平，提升p-IR，p-IRS1，p-Akt和膜GLUT4(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4)蛋白的表達(dá)，從而修復(fù)糖尿病鼠的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。雖然受損β細(xì)胞的胰島素合成和分泌未顯著增加，但胰島形態(tài)在Vglycin/PA1b影響下得到了改善，胰島素敏感性增加，胰腺功能得到恢復(fù)[34]。Vglycin/PA1b可通過促進(jìn)β細(xì)胞增殖、抑制凋亡和分化從而補(bǔ)充β細(xì)胞數(shù)量，改善糖尿病鼠體內(nèi)葡萄糖自穩(wěn)平衡[35]。另外，PA1b具有良好的穩(wěn)定性，能抗胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，長(zhǎng)期給藥安全性較好[5]。這些研究提示Aglycin/Vglycin/PA1b有開發(fā)成口服藥劑用于糖尿病的預(yù)防和治療的潛力[5,14,34-37]。

3 PA1b的異源表達(dá)

基于PA1b在農(nóng)業(yè)病蟲害防治和糖尿病藥物開發(fā)中的巨大潛力，大量獲取PA1b蛋白進(jìn)行工業(yè)規(guī)模應(yīng)用或者深入研究作用機(jī)制就顯得十分必要。PA1b存在許多同源異構(gòu)體，它們序列非常相似，通過生物化學(xué)分離方法來逐一純化它們是很困難甚至是不可能的[6]。因此，為了研究某個(gè)特定的PA1b異構(gòu)體的功能，有必要將其表達(dá)在異源系統(tǒng)中。雖然可以通過體外化學(xué)合成的方法合成有活性的PA1b[38]，但是技術(shù)復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)耗資高，最理想的還是通過基因工程手段將PA1b在異源系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。

在植物中表達(dá)PA1b的嘗試最早是Ealing等[39]報(bào)道的。由于PA1b富含半胱氨酸，他們以提高反芻動(dòng)物食用的牧草中含硫蛋白質(zhì)的量為目的，將PA1基因用農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入白三葉草中制備成轉(zhuǎn)基因白三葉草，結(jié)果只檢測(cè)到高水平的PA1mRNA，相應(yīng)的原蛋白幾乎檢測(cè)不到，只在嫩葉中發(fā)現(xiàn)微量的PA1a，全株植物中未檢測(cè)到PA1b，說明PA1b以及絕大部分PA1a可能在蛋白加工過程中被白三葉草中內(nèi)源性蛋白酶降解了。提示異源表達(dá)PA1b必須考慮PA1前原蛋白加工過程的穩(wěn)定性問題，不能忽視PA1a的作用。2013年，Eyraud等[25]的研究結(jié)果印證了這一論點(diǎn)，他們利用農(nóng)桿菌侵染法將完整的PA1cDNA導(dǎo)入煙草葉片中，大量表達(dá)出了有活性(能夠殺傷象鼻蟲和Sf9昆蟲細(xì)胞)的PA1b(達(dá)35 mg/g鮮葉)，表達(dá)量在侵染后8天達(dá)到最大值，隨后銳減。而單獨(dú)轉(zhuǎn)化PA1b的cDNA則無法表達(dá)出PA1b，證實(shí)了PA1a的重要性。后來范亞軍等[40]也同樣用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建在瞬時(shí)表達(dá)載體pCAPE2上的PA1b基因轉(zhuǎn)入發(fā)芽的豌豆種子中，在豌豆植株中過表達(dá)了PA1b蛋白，為進(jìn)一步研究PA1b抗蟲機(jī)制提供了基礎(chǔ)。另外從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度來看，PA1b作為一種優(yōu)質(zhì)的食源性硫蛋白，在亞洲的黃豆品系中含量很高，但是北美品系中幾乎不含[41]。2015年，Krishnan等[42]用漸滲雜交技術(shù)將leginsulin/PA1b基因轉(zhuǎn)移到一種北美黃豆品系中，使之大量表達(dá)出leginsulin/PA1b，也提升了該品系的總蛋白含量，可用于制作高品質(zhì)豆腐。

PA1b在酵母中的表達(dá)見李弘劍等[43]的研究，他們將PA1b基因克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαA上，導(dǎo)入GS115酵母菌中用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)基經(jīng)過超濾和HPLC分離獲得重組PA1b，得率約10 mg/L。重組PA1b對(duì)象鼻蟲敏感株表現(xiàn)出很強(qiáng)的毒力，而對(duì)象鼻蟲抗性株無明顯毒力，這與直接純化自豌豆種子的PA1b毒力一致。

大腸桿菌是最常用的原核表達(dá)宿主，PA1b作為真核基因在其中表達(dá)，必須考慮如何保證分子內(nèi)二硫鍵正確形成、肽鏈正確折疊等因素。在大腸桿菌中表達(dá)出有活性PA1b的報(bào)道最早見于2003年，Hanada等[27]在BL21大腸桿菌中導(dǎo)入完整的PA1基因，能表達(dá)出具有活性的leginsulin/PA1b，分子內(nèi)二硫鍵正確，也能和受體43kDa蛋白結(jié)合。杜雯等[44]將PA1b對(duì)應(yīng)的cDNA與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)基因構(gòu)建成融合基因在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行了可溶性表達(dá)，然而細(xì)菌周質(zhì)空間中表達(dá)量太低，以及融合蛋白中MBP標(biāo)簽去除需經(jīng)Factor Xa酶切成本高，因而并無后續(xù)。另有Louis等[10]嘗試在大腸桿菌中表達(dá)PA1b，僅轉(zhuǎn)化PA1b對(duì)應(yīng)的cDNA，結(jié)果顯示盡管形成了3對(duì)二硫鍵，PA1b的產(chǎn)量非常低，而且是沒有正確折疊的無活性形式。因此，推測(cè)PA1a在翻譯后加工過程中起著重要作用，它可能作為分子伴侶有助于PA1b正確折疊，從而保證PA1b獲得相應(yīng)的生物活性。最近，黃敏華等[45]將Aglycin/PA1b通過一個(gè)能在體外進(jìn)行自剪切的內(nèi)含肽MxeGyrA與自組裝肽ELK16連接，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，得到目的蛋白聚集體，隨后進(jìn)行DTT切割，最終得到純度為98.15%、產(chǎn)量為5.53 mg/g菌體濕重的Aglycin肽。該肽有比阿卡波糖更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，證明其有開發(fā)為降糖藥劑的潛力。

4 PA1b的應(yīng)用與展望

PA1b調(diào)節(jié)血糖的活性已經(jīng)在多項(xiàng)細(xì)胞和活體實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)。PA1b為豆科植物所特有，對(duì)于人和其他哺乳動(dòng)物來說是一種安全的食源性含硫蛋白，食用后沒有毒性和變應(yīng)原性，而且可以耐受胃蛋白酶的降解，在腸道中保持活性。因而PA1b具有開發(fā)成口服降糖藥物的廣闊應(yīng)用前景。

PA1b的另一顯著活性是昆蟲毒性，可開發(fā)成一種理想的生物殺蟲劑。它能特異性殺害象鼻蟲、蚜蟲等害蟲而不損害蜜蜂等益蟲，因而可大規(guī)模應(yīng)用。PA1b蛋白家族賦予豆類種子特異的殺蟲活性，在糧食儲(chǔ)藏和飼料加工中可適量添加豆粉，使糧食和飼料抵抗害蟲侵蝕從而更耐儲(chǔ)藏，減少化學(xué)保藏劑的有害作用[46]。此外，面包制作中添加少量豌豆粉水解物可使面包在室溫下至少儲(chǔ)藏21天而不染真菌，同添加0.3%丙酸鈣一樣具有防腐效果，水解物中抗真菌多肽成分之一被鑒定為PA1b[47]，說明PA1b可能開發(fā)成安全的食品防腐劑。

PA1b化學(xué)本質(zhì)是多肽，可用基因工程技術(shù)進(jìn)行異源表達(dá)，從而大量制備。在異源表達(dá)系統(tǒng)中如何提升PA1b的表達(dá)量，以及如何促進(jìn)PA1b正確折疊成活性形式是需要重點(diǎn)考慮的問題。鑒于PA1b同源異構(gòu)體之間活性存在差異，隨著對(duì)PA1b結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究不斷深入，將有可能開發(fā)出氨基酸序列更優(yōu)化的重組PA1b來增強(qiáng)其活性，擴(kuò)展應(yīng)用范圍。