劉麗欣，郭正光，孫偉，劉俊濤*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，國家婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100730；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100730)

子癇前期(Preeclampsia，PE)是一種妊娠期特發(fā)的疾病，發(fā)病率為2%～8%，可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒生長受限、妊娠后婦女心血管病以及新生兒和產(chǎn)婦死亡等[1-2]。盡管在過去幾十年中進(jìn)行了深入的研究，但PE的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此缺乏特異性的檢測指標(biāo)和方法來進(jìn)行早期診斷或預(yù)測疾病的嚴(yán)重程度，目前分娩是唯一有效的治療方法。

早在PE臨床特征表現(xiàn)之前致病因素就已產(chǎn)生，因此及時診斷和適當(dāng)治療，可以改善孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)期結(jié)局。然而，臨床中可靠的篩選試驗(yàn)尚未廣泛開展，多普勒超聲測量的子宮動脈搏動指數(shù)(PI)、可溶性酪氨酸激酶1(sFlt-1)、胎盤生長因子(PlGF)、可溶性內(nèi)皮素(sEng)、胎盤蛋白13(PP-13)、妊娠相關(guān)血漿蛋白 a(PAPP-a)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，已被提議作為PE檢測的潛在生物標(biāo)記物[3-5]。Zeisler等[5]指出，血清sFlt-1/PlGF比率可以在妊娠24～36周時預(yù)測未來幾周內(nèi)是否會出現(xiàn)PE。然而，由于敏感性和特異性較低，這些標(biāo)記物目前均未在臨床上用于早期產(chǎn)前篩查。因此，發(fā)現(xiàn)相關(guān)的生物標(biāo)志物，對幫助準(zhǔn)確預(yù)測、診斷和治療監(jiān)測PE至關(guān)重要。

質(zhì)譜技術(shù)擁有較高的靈敏度和準(zhǔn)確率，已經(jīng)逐漸成為蛋白質(zhì)組學(xué)主要的研究方法[6]。蛋白質(zhì)組定量技術(shù)按數(shù)據(jù)采集模式可分為數(shù)據(jù)依賴采集(DDA)和數(shù)據(jù)非依賴采集(DIA)兩種。DIA對所有窗口進(jìn)行無偏向的數(shù)據(jù)采集，故DIA分析產(chǎn)生的定量結(jié)果比DDA具有更好的信噪比和重現(xiàn)性，可以為低豐度蛋白質(zhì)提供準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定量信息，在臨床樣本的研究中擁有廣泛的研究前景[7-8]。本研究希望借助蛋白質(zhì)組學(xué)方法找到PE與正常妊娠之間存在的差異蛋白，分析其作用的相關(guān)信號通路，為尋找鑒別PE的生物標(biāo)志物研究奠定基礎(chǔ)，以期應(yīng)用于PE的早期診斷、監(jiān)測及處理，進(jìn)而減少子癇、胎兒相關(guān)嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。

材料與方法

一、研究對象

選取2019年9—12月就診北京協(xié)和醫(yī)院、符合PE診斷標(biāo)準(zhǔn)的孕婦為研究對象，選取同期正常妊娠孕婦為對照組。

PE診斷標(biāo)準(zhǔn)：妊娠 20周后血壓升高，收縮壓≥140 mmHg 和(或)舒張壓≥ 90 mmHg，伴有蛋白尿≥ 3.0 g/24 h，或隨機(jī)尿蛋白(+)或雖無蛋白尿，但出現(xiàn)以下標(biāo)準(zhǔn)之一者：血小板減少(血小板<100×109個/L)；肝功能受損(血清轉(zhuǎn)氨酶水平為正常濃度的2倍以上)；腎功能損害(血肌酐水平大于1.1 mg/dl或濃度升高至正常濃度的2倍以上)；肺水腫；新發(fā)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)異?；蛞暳φ系K。排除妊娠合并免疫病、腎病、慢性高血壓等合并癥及并發(fā)癥。本研究通過北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(ZS-2748)，患者簽署知情同意書。

本研究共納入PE患者(P組)5例，對照組(C組)7例。

二、儀器與試劑

Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀(Thermo Fisher，美國)、NanoEasy 1200高效液相色譜儀(Thermo Fisher，美國)、免疫親和柱(Thermo Fisher，美國)、二硫蘇糖醇(Sigma，美國)、碘乙酰胺(Sigma，美國)、胰蛋白酶(Promega，美國)、BCA試劑盒(Thermo Fisher，美國)。

三、方法

1.血液、尿液樣本采集和儲存：采集孕婦剖宮產(chǎn)分娩前24 h、分娩后24 h外周血血清及尿液，尿液需排除感染及血液污染，-20℃冰箱短暫保存，-80℃冰箱長期保存。

2.樣本處理：血清樣本利用免疫親和層析柱去除高豐度蛋白；尿液經(jīng)3 000 rpm，4℃，離心10 min去除細(xì)胞碎片沉渣，二硫蘇糖醇還原蛋白質(zhì)，碘乙酰胺烷基化蛋白質(zhì)，加入丙酮純化后離心，沉淀用Tris溶液(三羥甲基氨基甲烷)復(fù)溶，即為尿液蛋白。血、尿蛋白質(zhì)利用胰蛋白酶酶解成肽段，收集酶解液，利用BCA試劑盒測定肽段濃度。

3.質(zhì)譜鑒定：取15 μl樣本，與iRT肽段1 μl混合，用串聯(lián)質(zhì)譜儀分離，利用在線電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜方法進(jìn)行分析。共上樣4 μl樣品(分析柱：75 μm×25 cm，Acclaim PepMap C18)，以60 min的梯度分離樣品，柱流量控制在250 nl/min，柱溫為40℃，電噴霧電壓為2 kV。流動相A相為0.1% 甲酸水溶液；B相為含0.1% 甲酸的乙腈溶液。

肽段經(jīng)由HPLC系統(tǒng)分離后，使用數(shù)據(jù)非依賴性采集模式進(jìn)行質(zhì)譜分析肽段混合物，質(zhì)譜過程參數(shù)設(shè)置如下：(1)一級質(zhì)譜MS：掃描范圍為350～1 200 m/z，分辨率為120 000，AGC target為300，最大注入時間為50 ms；(2)HCD-MS/MS：分辨率為30 000，AGC target為200，碰撞能量為25 eV、30 eV和35 eV，F(xiàn)AMIS電壓為45 V；(3)設(shè)置60個可變窗口進(jìn)行采集，并同時設(shè)置重疊串口，每個窗口重疊設(shè)置為1 m/z。所有樣本隨機(jī)順序上機(jī)分析。所有樣本等量混合制備混合樣本作為質(zhì)控樣本(即Mix組)。質(zhì)控樣本在分析前、分析后和每10個樣本之間穿插上機(jī)分析，用以評估系統(tǒng)穩(wěn)定性。

4.DIA數(shù)據(jù)分析：采用Spectronaut數(shù)據(jù)庫的默認(rèn)參數(shù)，根據(jù)軟件自動選擇理想的窗口進(jìn)行提取，iRT肽段軟件也可以自動矯正保留時間及質(zhì)量窗口。Spectronaut自行校正后，符合條件的一級質(zhì)譜離子都需要進(jìn)行計(jì)算表達(dá)量，其他的干擾離子均需要去除(除非<3個碎片離子)。DIA二級分析對假陽性率<1%、排在前三的肽段進(jìn)一步定量。篩選差異蛋白標(biāo)準(zhǔn)：Test分析P<0.05為差異蛋白。

5.生物信息學(xué)分析：對所有篩選出的差異蛋白進(jìn)行生物通路分析(IPA)，將這些有差異表達(dá)的蛋白質(zhì)的差異倍數(shù)及Swissprot編號錄入IPA，并對不同組差異蛋白的結(jié)果進(jìn)行比較。根據(jù)相關(guān)通路中涉及的差異蛋白數(shù)目，采用left-tailed Fisher’s精確檢驗(yàn)法進(jìn)行計(jì)算相關(guān)通路的顯著性，并通過氣泡圖z評分和P值進(jìn)行排序。

結(jié) 果

一、各組蛋白的定量分析和質(zhì)量控制

血清中鑒定蛋白平均數(shù)分別為Mix組875個、P組839個、C組828個；尿液中鑒定蛋白平均數(shù)分別為Mix組1 644個、P組682個、C組1 378個。兩組測定蛋白經(jīng)主成分分析及聚類分析，結(jié)果說明分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性、重復(fù)性良好(圖1～2)。

A：血清蛋白；B：尿液蛋白。

二、差異蛋白篩選

通過DIA方法進(jìn)行血清、尿液差異蛋白鑒定，共篩選出血清中差異蛋白274個，其中P組84個，上調(diào)67個，C組190個，上調(diào)73個；尿液中差異蛋白671個，其中P組449個，上調(diào)224個，C組222個，上調(diào)105個。紅色為表達(dá)上調(diào)蛋白，藍(lán)色為表達(dá)下調(diào)蛋白，綠色為表達(dá)無差異蛋白(圖3～4)。

對差異蛋白進(jìn)行組內(nèi)及組間比較，具有重要功能的差異蛋白在P組和C組血清和尿液中變化趨勢相對一致。P組變化趨勢不一致的差異蛋白在產(chǎn)后血清中表達(dá)下調(diào)、尿液中表達(dá)上調(diào)，包括PRDX2、CD99、ITGB1三個蛋白；其中CD99、ITGB1與C組變化趨勢一致，即產(chǎn)后血清中下調(diào)，尿液中上調(diào)表達(dá)；而PRDX2與C組表達(dá)變化不同，即C組產(chǎn)后血清和尿液中均上調(diào)表達(dá)。

三、生物通路分析

1.心血管與高血壓相關(guān)通路：與C組相比較，P組產(chǎn)前、產(chǎn)后血液中差異蛋白在通路中變化不顯著，但尿液中差異蛋白在腎素-血管緊張素信號通路、擴(kuò)張型心肌病信號通路、心臟-β-腎上腺素能信號通路、心肌肥厚信號通路、腎上腺髓質(zhì)素信號通路中具有顯著激活作用(圖5)。

A：血清蛋白；B：尿液蛋白。

A：C組；B：P組。紅色：上調(diào)；藍(lán)色：下調(diào)；綠色：無差異。

A：C組；B：P組。紅色：上調(diào)；藍(lán)色：下調(diào)；綠色：無差異。

C1/C3：C組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比；P1/P3：P組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比。紅色表示激活，藍(lán)色表示抑制，氣泡越大，相關(guān)性越強(qiáng)。

2.細(xì)胞增殖與血管發(fā)生通路：與C組相比較，P組血液中VEGF水平下降；P組尿液中與血管發(fā)生相關(guān)的Ephrin受體信號通路、TGF-β信號通路激活，Ephrin B 通路受到抑制(圖6)。

3.內(nèi)皮損傷相關(guān)通路：與C組相比較，P組尿液中差異蛋白在NRF2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路、HIF1信號通路和鐵死亡信號通路中具有激活作用(圖7)。

C1/C3：C組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比；P1/P3：P組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比。紅色表示激活，藍(lán)色表示抑制，氣泡越大，相關(guān)性越強(qiáng)。

4.細(xì)胞免疫相關(guān)通路：與C組相比較，P組血液中差異蛋白變化不明顯，但尿液中差異蛋白在嗜酸性粒細(xì)胞通路、中性粒細(xì)胞通路、樹突狀細(xì)胞(DC)通路中均不同程度的激活，差異蛋白在T細(xì)胞輔助1型(Th1)和Th2通路富集(圖8)。

C1/C3：C組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比；P1/P3：P組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比。紅色表示激活，藍(lán)色表示抑制，氣泡越大，相關(guān)性越強(qiáng)。

C1/C3：C組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比；P1/P3：P組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比。紅色表示激活，藍(lán)色表示抑制，氣泡越大，相關(guān)性越強(qiáng)。

與C組相比較，P組血液中差異蛋白變化不顯著，但P組尿液差異蛋白可以激活白細(xì)胞介素8(IL-8)、IL-2、IL-15、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)信號通路(圖9)。

與C組相比較，P組尿差異蛋白在B細(xì)胞通路激活，IL-4通路差異蛋白富集；C組尿液中補(bǔ)體途徑明顯抑制，相比之下P組血液中差異蛋白補(bǔ)體增加(圖10)。

C1/C3：C組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比；P1/P3：P組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比。紅色表示激活，藍(lán)色表示抑制，氣泡越大，相關(guān)性越強(qiáng)。

C1/C3：C組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比；P1/P3：P組產(chǎn)前與產(chǎn)后相比。紅色表示激活，藍(lán)色表示抑制，氣泡越大，相關(guān)性越強(qiáng)。

討 論

PE是一種嚴(yán)重危害孕婦和嬰兒健康的疾病，引起PE的原因有很多且彼此之間存在一定關(guān)聯(lián)，因此單方面的原因和發(fā)病機(jī)制無法完整解釋PE的發(fā)生。為了更好地了解PE的發(fā)病原因，本研究利用質(zhì)譜方法，檢測了PE患者血清和尿液中的差異蛋白，并通過生物信號通路分析，初步探索了與PE相關(guān)的通路變化。

差異蛋白IPA經(jīng)典通路分析結(jié)果表明PE與心血管系統(tǒng)及高血壓通路調(diào)節(jié)密切相關(guān)。胎盤缺血可產(chǎn)生腎素和血管緊張素類物質(zhì)導(dǎo)致血壓升高，心臟-β-腎上腺素信號增強(qiáng)與血壓升高正相關(guān)，心肌肥厚信號及Apelin內(nèi)皮細(xì)胞信號通路參與了心血管調(diào)控與免疫，這些均與PE形成相關(guān)[9]。懷孕期間血流動力學(xué)改變，包括孕中期收縮壓、舒張壓和平均動脈壓降低，孕晚期略有升高[10]。懷孕期間心血管還會發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，這種適應(yīng)性重塑導(dǎo)致母體心肌肥大，這種肥大是可逆的，使心臟能夠應(yīng)對妊娠期增加的需求，與長期心血管功能障礙無關(guān)[10]，但有研究報(bào)道PE病人血管阻力增加，左心室壁增厚[11]，可能已形成不可逆的心肌肥大，PE病人在妊娠后的心血管疾病風(fēng)險也較正常孕婦高，并且這種風(fēng)險可以持續(xù)超過二十年[12]。

研究顯示VEGF水平下降，會影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化和增殖，造成滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入功能障礙，胎盤螺旋小動脈重塑受阻[13]。Ephrin B信號抑制，與血管發(fā)生異常相關(guān)[14]。與本研究血管發(fā)生通路顯示PE組血中VEGF水平下降、PE組尿液差異蛋白顯示Ephrin B信號通路抑制相符。報(bào)道稱TGF-β通路普遍低甲基化，且在PE病人胎盤中表達(dá)增加[15]，與本研究PE組TGF-β信號激活相符，該通路與滋養(yǎng)層入侵和遷移的控制有關(guān)。TGF-β在PE患者的血清中升高，并且可抑制許多組織中的VEGF[16]，這與本研究血漿中VEGF表達(dá)水平降低相符合。

鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種程序性細(xì)胞死亡形式，近幾年來，不斷有學(xué)者指出鐵死亡在胎盤功能障礙和滋養(yǎng)層損傷中的潛在作用，且可能與PE發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性，鐵過量及鐵死亡均會使胎盤血管侵襲受阻[17]，可加重脂質(zhì)過氧化，造成內(nèi)皮損傷。有研究報(bào)道PE患者血清鐵濃度、鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度顯著高于正常組，鐵穩(wěn)態(tài)失衡與PE相關(guān)[18]。胎盤植入過程中通常會產(chǎn)生活性氧(ROS)[19]，由氧化應(yīng)激水平上調(diào)引起ROS和脂質(zhì)過氧化的積累通常與胎盤功能受損有關(guān)[20]。本研究中，PE組尿液中NRF2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路被激活，引起PE內(nèi)皮損傷。

Boeldt等[21]認(rèn)為中性粒細(xì)胞激活后粘附至血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)是PE內(nèi)皮損傷的主要原因。內(nèi)皮損傷是心血管疾病、炎癥發(fā)生發(fā)展過程的重要部分，炎癥又可觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞活化，活化的內(nèi)皮細(xì)胞又會導(dǎo)致中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)增加，進(jìn)一步導(dǎo)致級聯(lián)反應(yīng)[22]。活化的內(nèi)皮通過IL-8促進(jìn)中性粒細(xì)胞向胎盤遷移[23]，又可通過GM-CSF延長中性粒細(xì)胞的壽命[24]。PE女性子宮內(nèi)膜中激活的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量增加[25]，炎癥反應(yīng)過度激活，均會導(dǎo)致子宮小動脈重鑄障礙，進(jìn)一步影響胎盤著床。正常妊娠被認(rèn)為是一種Th2型免疫狀態(tài)，有利于免疫耐受環(huán)境。PE患者則表現(xiàn)為Th1/Th2失衡，是以Th1為主的母體促炎狀態(tài)[26]。DC 細(xì)胞在正常妊娠期間保持失活或未成熟，然而在PE期間會受到不適當(dāng)?shù)拇碳?。高濃度GM-CSF與DC 中表達(dá)的長鏈非編碼 RNA(lnc-DC)一起誘導(dǎo) DC 成熟[27-28]，成熟的DC 可以更有效地呈遞抗原，從而增加 Th1/Th17 細(xì)胞的增殖[28]，Th1/Th17 細(xì)胞會刺激促炎反應(yīng)，從而顯著降低母體耐受性。本研究顯示PE患者的DC細(xì)胞通路、GM-CSF通路被激活，與之前的研究相符。

PE患者尿液中差異蛋白結(jié)果表現(xiàn)為B細(xì)胞通路激活、血液中差異蛋白在補(bǔ)體系統(tǒng)富集。免疫紊亂激活單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)來執(zhí)行抗原提呈過程，促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，然后產(chǎn)生過量抗體[29]。B細(xì)胞在PE中被不規(guī)則地激活，可產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ-1型受體激動性自身抗體(AT1-AA)，這些抗體充當(dāng)激動劑并誘導(dǎo)信號通路，導(dǎo)致血管收縮和醛固酮分泌，從而刺激腎素-血管緊張素系統(tǒng)并增加血壓[30]。

本次研究找到差異蛋白較多，可作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。值得注意的是PE組產(chǎn)后血液中降低、尿液中升高的三個蛋白，分別是PRDX2、CD99、ITGB1，考慮可能是PE終止妊娠后病情好轉(zhuǎn)，因此相關(guān)蛋白在血液中快速下降，并通過尿液排出。然而CD99、ITGB1在PE組和正常組變化趨勢相同，PRDX2變化趨勢與正常組表達(dá)變化不同，但符合課題設(shè)想，因此需要待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步行靶向驗(yàn)證質(zhì)譜分析。

本研究是一項(xiàng)涉及大量循環(huán)蛋白質(zhì)和相關(guān)病理生理通路的研究，這些蛋白質(zhì)和通路可能為先兆子癇這一特定表型提供潛在的治療靶點(diǎn)。結(jié)合IPA通路分析，PE組差異蛋白參與了炎癥免疫反應(yīng)過度激活、內(nèi)皮損傷、血管發(fā)生異常等，激活腎素-血管緊張素、心肌肥厚等相關(guān)通路。尤其鐵死亡通路顯著被激活，考慮可能與PE發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)很多差異蛋白，這些蛋白有可能是PE相關(guān)病因，也有可能是PE疾病表現(xiàn)出的結(jié)果，這均需要我們進(jìn)一步進(jìn)行前瞻性研究，為后續(xù)篩選差異蛋白作為生物標(biāo)記物奠定了基礎(chǔ)。