鄧天勤，謝雨莉，江旋，焦淑靜，連文昌，李雪梅*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳 518028；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，深圳 518028；3.蘇州億康醫(yī)學(xué)檢驗有限公司，蘇州 215021)

遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(hereditary spherocytosis，HS)是一種紅細(xì)胞膜蛋白缺陷導(dǎo)致的遺傳性溶血性疾病[1]，以北歐和北美地區(qū)發(fā)病率最高，達(dá)1/2 000[2]，在國內(nèi)成人HS的發(fā)病率約1/100 000[3]。HS的臨床表現(xiàn)具有個體差異性，從無癥狀到輕、中及重度貧血，主要癥狀為貧血、黃疸、脾腫大和膽石癥；脾切除是治療HS的最有效方法[4-5]。

目前發(fā)現(xiàn)與HS相關(guān)的編碼紅細(xì)胞膜蛋白的基因有5個，以ANK1 基因(OMIM 612641)發(fā)生突變最常見[6]。ANK1基因定位于8號染色體p11.21，其編碼的蛋白稱為錨蛋白。ANK1基因突變所致的HS主要為顯性遺傳，約占75%，其中ANK1基因突變中有15%～20%為新生突變或無家族史[7]。對于有HS家族史的夫婦，可選擇單基因病植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing for monogenetic disease，PGT-M)生育健康子代。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免因等位基因脫扣(allele drop-out，ADO)、基因重組等因素所導(dǎo)致的診斷不明，目前臨床上普遍采用致病基因變異位點的直接檢測聯(lián)合基于第二代測序(next-generation sequencing，NGS)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)的連鎖分析技術(shù)[8]。針對家系成員不全的情況或針對新發(fā)變異患者，則可以利用攜帶致病突變的極體或者單個精子或胚胎作為連鎖分析的依據(jù)[9]。

本研究基于基因芯片檢測分析單精子SNP單體型方法，為1例因ANK1基因c.3641delC新發(fā)突變導(dǎo)致的HS男性患者構(gòu)建單體型，并為患者夫婦提供了PGT-M準(zhǔn)確有效的檢測，結(jié)果呈現(xiàn)如下。

資料與方法

一、研究對象

先證者，男性，30歲，因貧血10年，行脾切除術(shù)后20年，行孕前遺傳咨詢。全外顯子檢測發(fā)現(xiàn)，先證者攜帶ANK1基因c.3641delC雜合突變，其父母均未攜帶相同變異。在人類外顯子數(shù)據(jù)庫、參考人群千人基因組和人群基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)該突變，且該突變?yōu)橐拼a突變，依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[10]，提示該位點為致病變異(PVS1+PM2+PP4)。為阻斷致病基因的垂直傳遞，先證者夫婦在我院經(jīng)遺傳學(xué)咨詢后，選擇應(yīng)用單精子SNP單體型進(jìn)行PGT-M。本研究征得了先證者夫婦充分的知情同意，并通過了醫(yī)院倫理委員會的審查(LLYJ2022-056-030)。

二、研究方法

1.突變位點引物設(shè)計和體系建立：先證者為HS患者，檢測診斷報告顯示突變基因為ANK1基因c.3641delC雜合突變，考慮為新發(fā)突變，需設(shè)計能夠在外周血基因組DNA(genomic DNA，gDNA)和單精子全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification，WGA)產(chǎn)物都能夠得到擴(kuò)增的突變檢測體系，使用PrimerPremier5軟件設(shè)計該突變位點的引物，并通過多次PCR反應(yīng)調(diào)試出穩(wěn)定檢測突變的反應(yīng)體系。

2.SNP位點選擇和檢測體系設(shè)計：根據(jù)歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會發(fā)布的指南以及胚胎植入前遺傳學(xué)診斷篩查技術(shù)的專家共識的要求[11-12]，利用Illumina公司Asian Screening Array(ASA)基因芯片對樣本基因組范圍內(nèi)SNP檢測，共檢測659 184位點。根據(jù)指南要求在患者突變基因的上下游1 Mb范圍內(nèi)，選擇至少2個可分析位點進(jìn)行分析，同時擴(kuò)展上游2 Mb、下游1 Mb范圍內(nèi)分析位點進(jìn)行SNP單體型分析，保證上下游有充足可用的SNP位點用于單倍體連鎖分析。

3.單精子獲取和WGA擴(kuò)增：將冷凍精液(不加精子保護(hù)液)解凍混勻，梯度稀釋500倍左右，使用顯微鏡在100×鏡下觀察，視野內(nèi)1～10個單細(xì)胞為最佳挑取濃度，一共分離50份單精子，分離好的單精子使用基于多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)原理的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒(KT110700150，蘇州億康)[13]，進(jìn)行單精子的WGA擴(kuò)增。由于分離過程有可能取到多條精子，因此單精子的WGA產(chǎn)物，最終通過位點驗證、拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)及SNP確定是否成功分離單個精子。

4.家系樣本和單精子突變位點檢測：收集患者夫婦雙方的外周血，提取gDNA，和單精子WGA產(chǎn)物作為模板，使用方法1中設(shè)計的突變位點引物和反應(yīng)體系，進(jìn)行男方新發(fā)突變的位點檢測，復(fù)核男方突變位點，以及女方是否為野生型，同時查看每個單精子的突變攜帶情況，選取單精子WGA產(chǎn)物的基因突變位點驗證為突變或者野生型的樣本(初步判定為單精子)，繼續(xù)做CNV和SNP單體型構(gòu)建。

5.單精子CNV建庫、NGS和分析：使用單精子樣本的WGA產(chǎn)物(突變或無突變位點的)為模板，按照基因測序文庫試劑盒(XK-038-48，序康)說明書進(jìn)行，完成單精子CNV文庫的制備。文庫混合后使用illumina Nextseq550測序儀進(jìn)行SE55測序方式完成測序。CNV數(shù)據(jù)使用億康開發(fā)的ChromGo生信分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，明確為單倍體的單精子樣本再進(jìn)行SNP的文庫構(gòu)建和ASA基因芯片測定，分別挑選3個以上的野生型和突變型的單精子樣本開展SNP的檢測，構(gòu)建有效的SNP單體型。

6.家系樣本和單精子樣本的SNP擴(kuò)增、文庫制備以及ASA基因芯片檢測：使用家系樣本gDNA和單精子樣本的WGA產(chǎn)物(突變或無突變位點的)為模板，再進(jìn)行DNA擴(kuò)增、DNA片段化、片段產(chǎn)物純化、重懸DNA、雜交、芯片洗滌、延伸和染色、上機(jī)掃描，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得相應(yīng)SNP位點信息。

7.SNP連鎖分析：使用億康開發(fā)的ChromGo生信分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。選取男女方標(biāo)本以及突變型和野生型的單精子SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建有效的SNP單體型，用于后續(xù)協(xié)助胚胎攜帶情況的診斷。

8.胚胎PGT-M的檢測(含診斷和篩查)：選擇形態(tài)學(xué)較好的囊胚進(jìn)行活檢，取3～5個左右的滋養(yǎng)層細(xì)胞，活檢細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5 μl裂解液的專用采集管(XK-043，序康)，使用基于MALBAC原理的基因測序通用樣本處理試劑盒(XK-028-24，序康)[13]，進(jìn)行囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的WGA擴(kuò)增。使用相同的分析軟件ChromGo進(jìn)行CNV和SNP的連鎖分析。

9.羊水檢測：抽取先證者妻子孕中期羊水10 ml，用試劑盒提取gDNA后，進(jìn)行母源污染排查、突變位點檢測以及核型分析，通過Sanger測序檢測胎兒攜帶ANK1基因c.3641delC雜合突變致病變異的情況。

結(jié) 果

一、單精子的WGA檢測結(jié)果

一共挑取40份編號為SSYC1～40單精子進(jìn)行WGA擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳條帶主要集中在200～2 000 bp，呈現(xiàn)典型的彌散狀條帶(圖1)，濃度在13～25 ng/μl，符合WGA擴(kuò)增的質(zhì)控預(yù)期。

除了2號和3號泳道的SSYC40單精子樣本為WGA擴(kuò)增失敗，其他13號、31號和39號泳道可能是挑取轉(zhuǎn)管等原因?qū)е拢渌?5份精子樣本均擴(kuò)增成功。

二、先證者夫妻雙方和部分單精子的突變位點檢測結(jié)果

先證者男方為胚系突變攜帶，女方為野生型，單精子SSYC07和SSYC10攜帶ANK1基因c.3641delC突變；單精子SSYC16和SSYC18不攜帶ANK1基因c.3641delC突變(圖2)。

圖1 單精子WGA擴(kuò)增電泳驗證圖

三、部分單精子的CNV結(jié)果

單精子的檢測判斷標(biāo)準(zhǔn)是染色體為23，X或23，Y，而且SNP檢測均為純合位點。SSYC07、SSYC16和SSCY18為23，Y的單精子染色體拷貝數(shù)結(jié)果，SSYC10為23，X的單精子染色體拷貝數(shù)結(jié)果(圖3)。

圖3 單精子CNV結(jié)果

四、先證者夫妻雙方及單精子的SNP分析

選取男方雜合、女方純合的SNP位點進(jìn)行連鎖分析，一共30個可用位點，結(jié)合單精子SSYC07、SSYC10、SSYC16、SSYC18的SNP結(jié)果，可以得出30個SNP位點的單體型結(jié)果，足夠用于單體型構(gòu)建。分析精子突變位點上游2 Mb及下游2 Mb總共407個SNP位點，突變型單精子SNP位點共有43個位點產(chǎn)生ADO，ADO率為10.56%；野生型單精子SNP共有30個位點產(chǎn)生ADO，ADO率為7.37%，均符合PGT-M指南對于SNP位點分析要求。隱馬爾科夫的SNP單體型連鎖圖展示了部分上下游可用位點(各15個)，藍(lán)色rs號為突變位點上游可用位點，黃色rs號為突變位點下游可用位點(圖4)。

五、胚胎PGT-M的檢測結(jié)果(含診斷和篩查)

一共獲得了4枚胚胎，進(jìn)行PGT-M檢測后，結(jié)果顯示2枚胚胎不攜帶父源突變(WYN01、WYN03)，4枚胚胎為46，XN胚胎(WYN01、WYN02、WYN03、WYN04)，綜合分析WYN01和WYN03號兩枚胚胎為可移植胚胎(表1)。其中胚胎平均SNP可用位點數(shù)(1 Mb范圍內(nèi))9以上(表2)，且胚胎的突變位點檢測(圖5)和SNP單體型分析均一致(圖6)。

■：患病男性，攜帶突變；○：正常女性，不攜帶突變；◇：性別未知，不攜帶突變；◆：患病，性別未知，攜帶突變；spm：單精子樣本；pat：父源單體型；mat：母源單體型；*：ADO；0：缺失數(shù)據(jù)；數(shù)字：距離基因上下游的相對距離(單位Kb)；左側(cè)SNP位點：藍(lán)色和黃色代表基因所在染色體位置上游或下游的 SNP 位點；單體型內(nèi)部的斜杠：左斜杠為與女方突變位點連鎖的SNP單體型，右斜杠為與男方突變位點連鎖的SNP單體型。

表1 胚胎植入前遺傳學(xué)檢測結(jié)果

表2 SNP分型連鎖分析結(jié)果

紅色框示突變位點。

六、產(chǎn)前診斷結(jié)果

2022年2月22日女方移植WYN01囊胚1枚，確認(rèn)成功妊娠后，于18周左右抽取胎兒羊水樣本提取DNA，進(jìn)行染色體核型、染色體微陣列分析及Sanger測序明確胎兒是否攜帶染色體變異及致病變異。2022年5月13日結(jié)果提示胎兒染色體核型及染色體微陣列分析正常，且未攜帶父源ANK1基因c.3641delC突變(圖7)，表明成功阻斷該新發(fā)突變的遺傳。

■：患病男性，攜帶突變；○：正常女性，不攜帶突變；◇：性別未知，不攜帶突變；◆：患病，性別未知，攜帶突變；spm：單精子樣本；pat：父源單體型；mat：母源單體型；*：ADO；0：缺失數(shù)據(jù)；數(shù)字：距離基因上下游的相對距離(單位Kb)；左側(cè)SNP位點：藍(lán)色和黃色代表基因所在染色體位置上游或下游的SNP位點；單體型內(nèi)部的斜杠：左斜杠為與女方突變位點連鎖的SNP單體型，右斜杠為與男方突變位點連鎖的SNP單體型。

箭頭示突變位點。

討 論

HS是一種常見的遺傳性溶血性疾病，其發(fā)病機(jī)制是基因突變導(dǎo)致紅細(xì)胞膜蛋白缺陷，主要致病基因有5種：ANK1、SLC4A1、SPTA1、SPTB和EPB42[14]。75%的HS為常染色體顯性遺傳，子代發(fā)病概率為50%，PGT-M是阻斷該疾病遺傳的有效途徑之一。ANK1基因突變中有15%～20%為新生突變或無家族史，這對PGT-M的連鎖分析提出了挑戰(zhàn)，無法按照常規(guī)的檢測流程進(jìn)行連鎖分析，增加了臨床開展PGT-M檢測的難度[15]。同時，在PGT-M過程中，擴(kuò)增失敗、優(yōu)勢擴(kuò)增、ADO、樣本污染等因素均可導(dǎo)致誤診或診斷不明[16]，ADO的發(fā)生率為10%～20%[17]。目前為降低誤診風(fēng)險的策略是聯(lián)合使用突變位點的直接測序和SNP連鎖分析[9]。

目前應(yīng)用于PGT的主要有兩種芯片技術(shù)：比較基因組雜交芯片(array comparative genome hybridization，aCGH)及SNP，SNP芯片技術(shù)的應(yīng)用優(yōu)勢在于檢測片段重復(fù)缺失或非整倍體的同時，還可以檢測單倍體以及多倍體異常。本研究采用ASA基因芯片方法，以突變型和野生型的單精子SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建有效的SNP單體型，協(xié)助胚胎攜帶情況的篩查和診斷。通過對4枚胚胎進(jìn)行CNV、SNP單體型以及突變位點檢測，結(jié)果顯示兩枚胚胎為可移植胚胎；孕中期羊水檢查證實胎兒未攜帶致病變異，有效阻斷HS致病突變基因的遺傳。國內(nèi)呂遠(yuǎn)等[18]通過NGS構(gòu)建單精子SNP單體型在軟骨發(fā)育不良患者的應(yīng)用，篩選2枚未攜帶致病基因胚胎，羊水驗證胎兒未攜帶致病突變基因，成功阻斷致病基因的遺傳，其ADO為12.5%。Shi等[19]采用同樣的方法對PKD1基因新發(fā)突變的常染色體顯性遺傳多囊腎患者行PGT-M，目前已出生2名未攜帶致病基因小孩。而本研究采用基因芯片方法，構(gòu)建精子SNP單體型，與上述研究構(gòu)建精子SNP單體型不一樣，ADO率為10.56%。單精子SNP單體型也應(yīng)用于其他新發(fā)突變的單基因疾病中，如脊髓性肌肉萎縮癥[20]、成骨不全癥[21-21]、馬方綜合征[23]和血紅蛋白H病[24]；同時也應(yīng)用于羅氏易位男性患者，成功篩選出正常胚胎[25]。也有報道應(yīng)用高通量測序多SNP單體型連鎖分析技術(shù)區(qū)分?jǐn)y帶或不攜帶親代羅氏易位染色體的胚胎，從而篩查出染色體正常的胚胎，幫助患者生育染色體正常的嬰兒[26]。

本研究采用的方法與常規(guī)的PGT-M相比較，有過程復(fù)雜、檢測時間長以及構(gòu)建單精子SNP單體型檢測費用較高的不足之處。在缺乏先證者或新發(fā)突變單基因疾病通過鏈讀測序構(gòu)建單體型的方法，不需要精子或極體，只需患者外周血，較本研究方法更簡單、SNP位點更豐富、應(yīng)用范圍更廣，且本研究采用的方法只能在男性患者中應(yīng)用[27]。

綜上，針對無家族史，新發(fā)突變的HS男性患者，因缺乏先證者，無法進(jìn)行連鎖分析，可采用基因芯片方法，構(gòu)建單精子SNP單體型，結(jié)合CNV及突變位點檢測，篩查未攜帶致病突變的胚胎，阻斷致病基因垂直傳遞。這也為其他新發(fā)突變常染色體顯性遺傳的單基因疾病的男性患者，在PGT-M過程中提供一種檢測方法，可提高PGT-M的準(zhǔn)確性。