李曉蕾，朱海生，麻瑞娟，胡 科，馮麗娜，王旭東

邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000

缺血性腦卒中約占腦卒中患者的72%，具有起病急、進展快的特點，是導致我國居民殘疾和死亡的首位病因［1］。通過靜脈溶栓或介入治療及時恢復血流再灌注，挽救缺血半暗帶神經(jīng)元是臨床治療缺血性腦卒中的首選方案。但血流再通后常導致腦功能缺損進一步加重，即腦缺血再灌注損傷，炎癥反應、細胞凋亡等是其發(fā)生、發(fā)展的重要病理機制［2-4］。研究顯示，Toll樣受體4/核因子-κB（tolllike receptor 4/nuclear factor-κB，TLR4/NF-κB）是調(diào)控炎癥反應和細胞凋亡的關(guān)鍵信號通路［5］，抑制TLR4/NF-κB通路可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷［6］。

藏紅花素提取自鳶尾科植物藏紅花，具有良好的抗炎、抗凋亡等作用［7-8］，通過抑制TLR4/NF-κB通路可減輕心衰大鼠炎癥反應、心肌細胞凋亡［9］和動脈粥樣硬化小鼠神經(jīng)炎癥［10］。有研究報道，藏紅花素能夠改善腦缺血再灌注損傷大鼠腦功能［11］，但其作用機制尚不明確。本研究旨在探討藏紅花素對局灶性腦缺血再灌注（focal cerebral ischemia-reperfusion，F(xiàn)CIR）大鼠神經(jīng)元的影響及可能的機制，以期為臨床防治腦缺血再灌注損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級雄性SD大鼠128只，7～8周齡，體質(zhì)量230～260 g，由河北伊維沃生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2020-002。于室溫25 ℃、濕度55%～65%的控制環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水進食。所有實驗動物操作均嚴格遵循動物實驗減少、替代、優(yōu)化原則，本實驗方案通過河北省邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會審批通過［批準號：

HDZXLL（K）2021-014］。

1.2 主要實驗藥物、試劑與儀器

1.2.1實驗藥物、試劑 藏紅花素（純度≥98%）（美國Sigma公司，批號：E190513b）；脂多糖（TLR4激活劑）（美國Invivogen公司，批號：511219ps）；氯化三苯四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液、HE染色試劑盒、TUNEL染色試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號分別為201227、210105、201124）；ELISA法腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司（批號分別為SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005）；TLR4抗體、NF-κB p65抗體、p-NF-κB p65抗體、IκBα抗體、p-IκBα抗體購自美國Affinity公司（批號分別為AF7017、AF5006、AF5019、AF6428、AF5281）；Cleved Caspase-3抗體、B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體購自英國Abcam公司（批號分別為ab54426、ab28517、ab31005）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、β-actin抗體、二抗、ECL發(fā)光液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號分別為C05-07004、bs-0061R、bs-0295G、C05-07004）。

1.2.2實驗儀器 BS224S型電子天平（德國Sartouris公司）；synergy H1型酶標儀（德國Biotec公司）；RM2015型切片機（德國Leica公司）；Tetra型電泳儀、Blot SD型轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；BX53型顯微鏡（日本日立公司）；KZ-Ⅱ型勻漿儀（北京Servicebio公司）。

1.3 實驗動物分組與模型制備

1.3.1實驗動物分組 將128只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、藏紅花素組、藏紅花素＋脂多糖組［12］，每組32只。

1.3.2模型制備方法

1.3.2.1藥物溶液配制 精確稱量400 mg藏紅花素溶解于100 mL生理鹽水中制備濃度為4 mg/mL的藏紅花素溶液；精確稱量10 mg脂多糖溶解于100 mL生理鹽水中制備濃度為0.1 mg/mL的脂多糖溶液，每天給藥前配制。

1.3.2.2模型制備前干預 模型制備前7 d開始，藏紅花素組通過腹腔注射藏紅花素溶液；藏紅花素＋脂多糖組通過腹腔注射藏紅花素溶液、脂多糖溶液；假手術(shù)組和模型組通過腹腔注射生理鹽水。參照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”進行換算，各組注射劑量均為5 mL/（kg·d），1次/d，連續(xù)干預7 d。

1.3.2.3動物模型制備 末次給藥12 h后，模型組、藏紅花素組、藏紅花素＋脂多糖組采用線栓法復制FCIR大鼠模型。該方法制備FCIR動物模型病理生理特征與人臨床接近，并且不開顱、操作簡便、重復性好，是缺血性腦卒中動物實驗研究的常用造模方法［13］。通過腹腔注射3%濃度的戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）實施麻醉，取仰臥位固定，沿頸正中線切口、鈍性分離肌肉和結(jié)締組織，游離右側(cè)頸總動脈和頸內(nèi)、頸外動脈，動脈夾夾閉頸總動脈，結(jié)扎頸外動脈，在頸外動脈剪1個小口并插入線栓，繞過分叉處進入頸內(nèi)動脈至大腦中動脈處，插入深度約18 mm，2 h后拔出線栓恢復血流再灌注，然后逐層縫合；假手術(shù)組暴露頸總、頸內(nèi)、頸外動脈后，即逐層縫合。根據(jù)LONGA等［14］神經(jīng)功能評分評定造模是否成功。標準如下：無癥狀為0分；左側(cè)前肢彎曲、不能完全伸展為1分；行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時向左側(cè)跌倒為3分；不能行走或翻正反射消失為4分。Longa評分2～3分即可認定造模成功。

1.4 觀察指標

1.4.1神經(jīng)功能缺失評分和腦梗死率測定 再灌注24 h后，各組分別采用隨機數(shù)字表法選擇8只大鼠，根據(jù)改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）評價大鼠神經(jīng)功能缺失程度［15］。評分越高表示神經(jīng)受損越嚴重。此外，通過腹腔注射3%濃度的戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）實施麻醉，頸椎脫臼處死，取腦組織并去除小腦、低位腦干，沿冠狀面切成6片，置于2% TTC溶液中37 ℃避光染色30 min，每5 min翻轉(zhuǎn)切片1次。通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算梗死區(qū)域面積。

1.4.2腦含水量測定 再灌注24 h后，各組分別隨機另取8只大鼠，通過腹腔注射3%濃度的戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）實施麻醉，頸椎脫臼處死，取腦組織并去除小腦、低位腦干后，稱質(zhì)量為濕質(zhì)量；置于110 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，即為干質(zhì)量。

1.4.3皮質(zhì)神經(jīng)元病理學改變和凋亡狀況觀察 各組分別隨機另取8只大鼠，通過腹腔注射3%濃度的戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）實施麻醉，頸椎脫臼處死，取腦組織并去除小腦、低位腦干，置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后制作5 μm厚度的石蠟切片。① 取部分切片經(jīng)脫蠟、透明處理后，按照試劑盒說明進行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，中性樹膠封片后通過顯微鏡觀察皮質(zhì)神經(jīng)元病理學改變。② 取部分切片，按試劑盒說明進行TUNEL染色，50%甘油封片后通過顯微鏡觀察皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡狀況（細胞核著黃褐色為凋亡細胞），每張切片取5個視野計算凋亡細胞數(shù)，各組取平均值后計算凋亡細胞百分比，即為凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.4.4腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測 分別取各組剩余的8只大鼠，通過腹腔注射3%濃度的戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）實施麻醉，頸椎脫臼處死，取腦組織并去除小腦、低位腦干，剪碎后加入裂解液，冰上研磨勻漿，3 500 r/min離心10 min取上清液，按照ELISA試劑盒說明進行處理后，通過酶標儀檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.4.5腦組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、Cleved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達檢測 取“1.4.4”項制備的腦組織勻漿液，4 ℃，12 000 r/min離心30 min取上清液，通過BCA試劑盒檢測總蛋白濃度后，沸水浴10 min使蛋白變性，然后采用Western blot法檢測蛋白相對表達量。SDS-PAGE電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后，目標蛋白和內(nèi)參（β-actin）一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL顯影，通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠mNSS評分、腦梗死率、腦含水量比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠mNSS評分、腦梗死率、腦含水量均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，藏紅花素組和藏紅花素＋脂多糖組mNSS評分、腦梗死率、腦含水量均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與藏紅花素組比較，藏紅花素＋脂多糖組mNSS評分、腦梗死率、腦含水量均明顯升高（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 4組mNSS評分、腦梗死率和腦含水量比較（xˉ±s）Table 1 Comparison of mNSS score，cerebral infarction rate and brain water content in four groups （xˉ±s）

圖1 4組FCIR大鼠腦梗死情況比較Figure 1 Comparison of cerebral infarction of FCIR rats in four groups

2.2 4組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元病理學改變比較

假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元可見排列紊亂、數(shù)量減少、空泡變性、胞漿固縮深染、核膜邊界不清、炎性細胞浸潤等病理學改變。與模型組比較，藏紅花素組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元上述病理學改變明顯減輕；與藏紅花素組比較，藏紅花素＋脂多糖組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元病理學改變明顯加重。見圖2。

圖2 4組皮質(zhì)神經(jīng)元病理學改變比較（HE，×200）Figure 2 Comparison of pathological changes of cortical neurons in four groups (HE, ×200)

2.3 4組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡比較

與假手術(shù)組比較，模型組皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，藏紅花素組和藏紅花素＋脂多糖組凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與藏紅花素組比較，藏紅花素＋脂多糖組凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。見圖3、表2。

表2 4組皮質(zhì)神經(jīng)元AI比較（xˉ±s）Table 2 Comparison of AI of cortical neurons in four groups （xˉ±s）

圖3 4組皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡比較（TUNEL，×200）Figure 3 Comparison of apoptosis of cortical neurons in four groups (TUNEL, ×200)

2.4 4組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，藏紅花素組和藏紅花素＋脂多糖組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與藏紅花素組比較，藏紅花素＋脂多糖組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4組腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較（xˉ±s）Table 3 Comparison of levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in brain tissue in four groups （xˉ±s）

2.5 4組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65、p-NFκB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達比較

與假手術(shù)組比較，模型組TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα表達比值均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，藏紅花素組和藏紅花素＋脂多糖組TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα相對表達量及p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα表達比值均明顯降低（P＜0.05）；與藏紅花素組比較，藏紅花素＋脂多糖組TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα相對表達量及p-NFκB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα表達比值均明顯升高（P＜0.05）。見圖4、表4。

圖4 4組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα和p-IκBα蛋白表達比較Figure 4 Comparison of the expression of TLR4, NF-κB p65, p-NF-κB p65, IκBα and p-IκBα proteins in the brain tissue in four groups

表4 4組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達及p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα表達比值比較（xˉ±s）Table 4 Comparison of the expressions of TLR4，NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα proteins and the ratio of p-NF-κB p65/NF-κB p65，p-IκBα/IκBα in the brain tissue in four groups （xˉ±s）

2.6 4組大鼠腦組織Cleved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達比較

與假手術(shù)組比較，模型組Cleved Caspase-3、Bax相對表達量和Bax/Bcl-2表達比值明顯升高，Bcl-2相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，藏紅花素組和藏紅花素＋脂多糖組Cleved Caspase-3、Bax相對表達量和Bax/Bcl-2表達比值明顯降低，Bcl-2相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與藏紅花素組比較，藏紅花素＋脂多糖組Cleved Caspase-3、Bax相對表達量和Bax/Bcl-2表達比值明顯升高，Bcl-2相對表達量明顯降低（P＜0.05）。見圖5、表5。

圖5 4組腦組織Cleved Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達比較Figure 5 Comparison of the expression of Cleved Caspase-3, Bcl-2 and Bax proteins in the brain tissue in four groups

表5 4組腦組織Cleved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達及Bax/Bcl-2表達比值比較（xˉ±s）Table 5 Comparison of the expression of Cleved Caspase-3，Bcl-2，Bax proteins and the ratio of Bax/Bcl-2 in the brain tissue in four groups （xˉ±s）

3 討 論

3.1 藏紅花素可保護FCIR大鼠神經(jīng)功能，減輕皮質(zhì)神經(jīng)元病理學改變

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)CIR模型大鼠mNSS評分、腦梗死率、腦含水量較假手術(shù)組明顯升高，皮質(zhì)神經(jīng)元呈現(xiàn)排列紊亂、數(shù)量減少、空泡變性、胞漿固縮深染、核膜邊界不清、炎細胞浸潤等病理學改變，這與鞏子漢等［16］研究結(jié)果相似。這提示FCIR過程導致神經(jīng)功能受損和皮質(zhì)神經(jīng)元病理改變。與模型組比較，藏紅花素預處理能夠明顯降低FCIR大鼠mNSS評分、腦梗死率和腦含水量，明顯改善皮質(zhì)神經(jīng)元病理學改變，這提示藏紅花素對FCIR大鼠神經(jīng)功能和皮質(zhì)神經(jīng)元具有保護作用，與溫彬等［11］研究顯示藏紅花素能夠減輕全腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能和腦組織病理改變的結(jié)果相似。這可能與以下因素有關(guān)：① FCIR可激活小膠質(zhì)細胞分泌TNFα、IL-1β、IL-6等炎癥因子，從而誘發(fā)炎癥反應，并且TNF-α趨化其他炎癥因子釋放而加重炎癥反應損傷，IL-1β則能夠刺激內(nèi)皮細胞上調(diào)表達黏附分子而促進炎細胞浸潤［17-18］。藏紅花素具有較好的抗炎活性［8-9］，能夠明顯降低FCIR大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平，抑制FCIR大鼠腦炎癥反應，從而改善FCIR大鼠神經(jīng)功能。② FCIR可誘發(fā)神經(jīng)元凋亡，皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡是FCIR損傷進行性加重的重要因素。Bcl-2和Bax定位于線粒體膜，Cleaved Caspase-3通過破壞結(jié)構(gòu)蛋白、膜蛋白、核酸等分子結(jié)構(gòu)而誘導細胞凋亡［19］。藏紅花素預處理能夠抑制FCIR大鼠腦組織Bcl-2表達下調(diào)和Bax、Cleaved Caspase-3表達上調(diào)，使Bax/Bcl-2比值降低。Bax能夠激發(fā)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔道開放促使細胞色素C（Cyt C）進入細胞質(zhì)，誘導Caspase-3活化；Bcl-2與Bax形成無活性的異源二聚體，從而對FCIR大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡起到抑制作用。這與江冉冉等［20-22］研究結(jié)果相似。

3.2 藏紅花素對FCIR大鼠神經(jīng)保護作用可能與調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB通路有關(guān)

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腦組織TLR4表達量和NF-κB p65、IκBα磷酸化（p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα）水平明顯升高，這提示FCIR誘導TLR4表達上調(diào)和NF-κB p65、IκBα磷酸化。與模型組比較，藏紅花素組腦組織TLR4表達量和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平明顯降低，這提示藏紅花素對FCIR大鼠神經(jīng)保護作用可能與調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB通路有關(guān)。這可能與以下因素有關(guān)：TLR4是一種模式識別受體，主要在腦神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞表達。NF-κB在生理狀態(tài)下以無活性的“p65/p50-IκBα”聚合態(tài)形式存在。研究表明，TLR4能夠誘導IκBα和NF-κB p65亞基磷酸化，促使“p65/p50-IκBα”聚合態(tài)解離，游離態(tài)p-NFκB p65核轉(zhuǎn)位后能夠與DNA結(jié)合而誘導TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達［23-24］，p-NF-κB p65能夠調(diào)控Bcl-2、Bax表達而促進細胞凋亡［25］。藏紅花素抑制FCIR大鼠腦炎癥反應和神經(jīng)元凋亡的作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB通路活化有關(guān)。這與CHEN等［6］研究結(jié)論相似。為了驗證上述推論，本實驗設(shè)置了藏紅花素＋脂多糖（TLR4激活劑）組，研究結(jié)果顯示，脂多糖能夠明顯逆轉(zhuǎn)藏紅花素對FCIR大鼠腦組織TLR4表達和NF-κB p65、IκBα磷酸化的調(diào)控作用，逆轉(zhuǎn)藏紅花素對FCIR大鼠神經(jīng)功能、腦炎癥反應、皮質(zhì)神經(jīng)元病理變化和凋亡的影響，進一步證實了藏紅花素對FCIR大鼠的保護作用與其抑制TLR4/NF-κB通路活化有關(guān)。

4 小 結(jié)

藏紅花素能夠抑制FCIR大鼠炎癥反應和皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡，減輕皮質(zhì)神經(jīng)元損傷，作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB通路活化有關(guān)。本研究結(jié)果為藏紅花素防治FCIR損傷提供了理論支持。