黃 佳，王夢雪，倪靜蕾，梁勝祥，林冰冰

1 福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建 福州 350122；

2 福建中醫(yī)藥大學康復產業(yè)研究院，福建 福州 350122

血管性認知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是腦血管病變及其危險因素導致的血管性腦損傷［1］，是除了阿爾茨海默病外最常見的癡呆癥亞型［2］。VCI患者常伴有記憶功能下降，這將影響患者日常生活活動能力［3］。在血管性疾病發(fā)生時，如何及時預測或診斷認知障礙的發(fā)生是臨床亟需解決的問題。研究顯示，髓鞘丟失和血管周圍間隙擴張等病理變化可在一定程度上預測血管性認知障礙［4］，但新的預測靶標及其作用機制仍然是目前研究的熱點。

研究顯示，持續(xù)腦血流的慢性下降是VCI發(fā)展的主要機制［5］，腦血流灌注減少與癡呆癥的嚴重程度密切相關［6］。多項臨床研究顯示，慢性腦缺血導致彌漫性白質纖維的改變與認知障礙密切相關［7-8］，但其分子機制尚未完全明確。雙側頸總動脈阻斷建立的慢性腦缺血模型已被廣泛用于研究VCI［9-13］。本研究采用慢性腦缺血模型模擬血管性認知障礙損害，通過彌散張量成像（diffusion tensor imaging，DTI）觀察海馬腦區(qū)和胼胝體白質神經纖維結構病理變化，分析學習記憶障礙中與白質神經纖維損害相關的髓鞘堿性蛋白和周細胞血小板衍生生長因子受體β（platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFR-β）變化，旨在闡明慢性腦缺血所致認知障礙與白質神經纖維損傷的相關性，探討VCI的預測分子靶標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇24只SPF級Sprague Dawley雄性大鼠，體質量（280±30）g，實驗動物購自上海斯萊克公司。實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實驗動物由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)［許可證號：SCXK（閩）2020-0002］，每籠≤5只，給予充足、自由飲食。所有實驗程序均嚴格按照動物實驗倫理規(guī)章進行。

1.2 主要實驗試劑與設備

動物用青霉素鈉（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：160萬單位）；異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司，批號：R510-22）；戊巴比妥鈉（美國默克Sigma公司，批號：CQ6125000）；堅牢藍（luxol fast blue，LFB）染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G3245）；Bicinchoninic acid蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；1∶3 000兔抗髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗體（美國Proteintech公司，批號：10458-1-AP）；1∶600兔抗PDGFR-β抗體（英國Abcam公司，批號：ab32570）；1∶5 000山羊抗兔抗體（英國Abcam公司，批號：ab6721）；Morris水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XM101）；小動物核磁共振成像儀（德國BRUKER公司，型號：MiniMR-60 MRI system 7.0 T）；小動物呼吸麻醉機（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；小動物生理檢測儀（美國型號：Smiths Medical公司，SurgiVet V3395TPR）；Western blot系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 實驗動物模型制備

24只大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、術后28 d組、術后56 d組，每組8只。參考FARKAS［14］雙側頸總動脈結扎造模方法模擬VCI慢性腦缺血病理狀態(tài)進行實驗動物模型構建。所有大鼠術前均禁食12 h，隨后對大鼠稱取體質量，用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）進行腹腔注射麻醉，醫(yī)用膠帶固定大鼠四肢，使其在手術保溫墊上處于仰臥位，進行頸部酒精消毒、剃毛備皮，沿大鼠頸正中線切開，分離淺表組織，分別從左、右兩邊的胸骨舌骨肌、胸鎖乳突肌和肩胛舌骨肌交叉點處向下找到兩側頸總動脈，分離頸總動脈與其旁邊伴行的迷走神經。假手術組大鼠僅分離雙側頸總動脈，不進行結扎。術后28 d組和術后56 d組大鼠在雙側頸總動脈充分暴露后，先用不可吸收的外科縫合線結扎左側頸總動脈，5 min后再結扎右側頸總動脈，隨后縫皮、清潔創(chuàng)口。所有大鼠在縫皮后腹腔注射20萬單位/mL動物用青霉素鈉溶液（0.05 mL/100 g）。

1.4 觀察指標

分別在造模成功后第28、56天進行以下指標評價。

1.4.1學習記憶能力 采用Morris水迷宮空間探索實驗評估3組大鼠的學習記憶能力。在Morris水迷宮（直徑150 cm×高50 cm）中，充滿適宜溫度（25±3）℃ 的水，水迷宮分為4個象限，在第3象限放入平臺（直徑10 cm×高30 cm），高出水平面5 cm；大鼠頭部朝向池壁，從4個不同的象限中點放入水中，讓大鼠在水中自由游動，大鼠自行登上平臺或實驗者引導大鼠至平臺后，讓大鼠在平臺上停留30 s，共訓練4 d。實驗第5天進行空間探索測驗，移走平臺，大鼠在90 s內尋找原平臺置放的目標區(qū)域，記錄大鼠進入目標區(qū)域（第3象限）的次數、在目標區(qū)域（第3象限）停留時間以及逃避潛伏期、路徑、平均速度。將攝像機與Super Maze動物行為學視頻采集分析系統(tǒng)連接，攝像機安裝在水迷宮上方監(jiān)測大鼠游泳動態(tài)。實驗后將大鼠用吸水紙吸干體表的水分，必要時采用白熾燈烘干后，放回籠中。

1.4.2大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)的白質神經纖維的變化 采用DTI檢測3組大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)的白質神經纖維的變化情況。3組大鼠用3%異氟烷在氧氣和空氣混合氣體（1∶4）中誘導麻醉，并用100 μg/mL的鹽酸美托嘧啶（0.15 mL/300 g）經下肢肌內注射以誘導大鼠深度麻醉。掃描時，大鼠置于核磁共振掃描床上呈俯臥位，頭部置于大鼠專用頭部表面線圈（掃描架內徑16 cm，使用內徑38 mm）內，以牙鉤和雙側耳桿固定其頭部，掃描過程中維持2%異氟烷氣體麻醉，水循環(huán)加熱系統(tǒng)維持大鼠體溫相對恒定。整個過程中通過小動物生理檢測儀實時監(jiān)測大鼠體溫、呼吸頻率、心率。DTI掃描參數如下：回波時間（time of echo，TE）＝32.25 ms，重復時間（time of repetition，TR）＝12 000 ms，視野（field of view，F(xiàn)OV）＝32 mm×32 mm，分割（segment）＝4，平均次數（averages）＝1，圖像大小（image size）＝128×128，層數（slices）＝48，彌散敏感系數b＝1 000 s/mm2，層厚（slice thickness）＝0.56 mm，無層間隙（no slice gap），時間（time）＝28 min。

采用FMRIB's Software Library（http：//fmrib.ox.ac.uk/fsl）和ITK-SNAP軟件進行數據分析。首先，進行渦流校正、顱骨剝離，得到全腦掩膜圖像；然后，計算大鼠全腦各向異性分數（fractional anisotropy，F(xiàn)A）和平均彌散率（mean diffusivity，MD）參數圖，手動確定胼胝體和海馬腦區(qū)感興趣區(qū)，提取感興趣區(qū)FA和MD平均值。

1.4.3大鼠胼胝體白質髓鞘脫失情況 采用堅牢藍（luxol fast blue，LFB）染色法檢測大鼠胼胝體白質髓鞘脫失情況。用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，0.9% NaCl溶液和4%多聚甲醛經心內灌注，腦組織行石蠟包埋，冠狀位切片，切片厚度為5 μm；經脫蠟脫水后，加入0.1% LFB溶液，于室溫密封浸染24 h；腦片經蒸餾水清洗后，由95%乙醇、0.05%碳酸鋰水溶液、70%乙醇分色，直至顯微鏡下觀察灰質和白質部位區(qū)分清晰，背景無色為止；中性樹膠封片。每組隨機選擇3只大鼠，在正置顯微鏡下觀察并拍照，每只大鼠取2張腦片，通過LFB染色法評價大鼠胼胝體白質髓鞘脫失情況。評分標準如下，① 0級：正常；② 1級：神經纖維結構紊亂；③ 2級：明顯空泡形成；④ 3級：有髓神經纖維消失。

1.4.4大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)的髓鞘堿性蛋白MBP和周細胞標志物PDGFR-β蛋白表達 采用免疫印跡法檢測大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)的髓鞘堿性蛋白MBP和周細胞標志物PDGFR-β蛋白表達。用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，0.9% NaCl溶液經心內灌注，閘刀斬斷大鼠頸椎，在冰面上鈍性剝離腦組織，分別剝離胼胝體和海馬腦區(qū)，并迅速放入液氮中冷凍，用組織剪將其剪碎放入勻漿機，加入等同于組織體積10倍的裂解液，充分裂解后離心30 min，取上清液，Bicinchoninic acid定量調齊濃度（5 μg/μL）并高溫變性（95～100 ℃，5 min）。配制分離膠，經上樣、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚偏二氟乙烯膜濕轉進行轉膜后，Tris鹽酸緩沖鹽溶液加吐溫漂洗5 min，用5%脫脂乳在室溫下封閉膜1 h，在4 ℃的環(huán)境下分別加入相應的一抗孵化過夜。Tris鹽緩沖液洗膜4次（5 min/次），37 ℃環(huán)境下用二抗避光孵育1 h。最后用紅外成像系統(tǒng)對曝光后的膠片掃描存檔，利用Image J軟件對目標帶灰度值進行定量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。計量資料符合正態(tài)分布者，數據以（xˉ±s）表示，組內不同時間點數據比較采用重復測量方差分析；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD-t法，方差不齊時采用Tamhane'sT2法；采用Pearson相關性分析MD與穿越平臺次數的相關性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

DTI數據分析步驟如下：① 使用MRIcroN軟件將DICOM格式的數據轉換為NIFTI格式；② 對DTI圖像進行渦流校正處理；③ 提取顱內掩模圖像，計算b0像和全腦FA像；④ 基于一般線性模型，采用單因素方差分析，對平滑后數據進行統(tǒng)計分析。P＜0.005，團簇＞10為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組學習記憶能力比較

Morris水迷宮定位航行實驗結果顯示，與假手術組比較，術后28 d組第2～4天逃避潛伏期均明顯延長，術后56 d組第3天逃避潛伏期明顯延長，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？臻g探索實驗結果顯示，與假手術組比較，術后28 d組和術后56 d組大鼠穿越平臺次數、目標象限時間占比均明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1～2及圖1。

圖1 3組大鼠水迷宮測試期游行軌跡圖Figure 1 The trajectories of rats during probe test in the Morris water maze

表1 3組逃避潛伏期比較（xˉ±s） sTable 1 Comparison of escape latency in three groups （xˉ±s） s

表2 3組穿越平臺次數、目標象限時間占比和速度比較（xˉ±s）Table 2 Comparison of crossing platforms times，target quadrant time ratio and speed in three groups （xˉ±s）

2.2 3組胼胝體和海馬腦區(qū)白質神經纖維變化比較

與假手術組比較，術后28 d組、術后56 d組左、右側胼胝體和左、右側海馬腦區(qū)白質神經纖維變化的MD值均明顯降低（P＜0.05）。與術后28 d組比較，術后56 d組MD值有下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 3組胼胝體和海馬FA、MD值比較（xˉ±s）Table 3 Comparison of FA，MD values of the callous corpus and hippocampus in three groups （xˉ±s）

2.3 3組胼胝體和海馬腦區(qū)MD值與學習記憶能力的相關性分析

Pearson相關性分析結果顯示，3組雙側胼胝體、海馬腦區(qū)MD值與穿越平臺次數均呈正相關關系，差異均具有統(tǒng)計學意義（r＝0.832，P＜0.01；r＝0.777，P＜0.01）。見圖2。

圖2 3組胼胝體、海馬腦區(qū)MD值與穿越平臺次數相關性分析Figure 2 Correlation analysis between MD values of the callous corpus and hippocampus and the number of crossing platforms in three groups

2.4 3組胼胝體髓鞘改變比較

研究結果顯示，與假手術組比較，術后28 d組、術后56 d組大鼠胼胝體部位著色程度均較淺，髓鞘結構紊亂明顯，甚至出現(xiàn)空洞。見圖3。通過對髓鞘紊亂分級進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，術后28 d組和術后56 d組髓鞘紊亂分級均明顯升高（P＜0.05）；與術后28 d組比較，術后56 d組大鼠髓鞘紊亂分級差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖3 3組大鼠胼胝體LFB染色圖（×100）Figure 3 LFB staining figure of the callous corpus of rats in three groups (×100)

圖4 髓鞘紊亂分級值統(tǒng)計圖Figure 4 Statistical plot of graded values of myelin sheath disorders

2.5 3組胼胝體和海馬腦區(qū)MBP和PDGFR-β蛋白表達含量變化比較

研究結果表明，與假手術組比較，術后28 d組、術后56 d組大鼠胼胝體、海馬腦區(qū)的髓鞘堿性蛋白MBP蛋白表達水平均明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；術后28 d組胼胝體PDGFR-β表達水平明顯升高（P＜0.05），術后28 d組、術后56 d組海馬腦區(qū)PDGFR-β表達水平均明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與術后28 d組比較，術后56 d組胼胝體PDGFR-β表達水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5、表4。

表4 3組胼胝體和海馬腦區(qū)MBP、PDGFR-β蛋白表達比較（xˉ±s）Table 4 Comparison of MBP，PDGFR-β proteins expression of the callous corpus and hippocampus in three groups （xˉ±s）

圖5 胼胝體和海馬腦區(qū)MBP、PDGFR-β蛋白條帶圖Figure 5 Bands of MBP, PDGFR-β proteins in the corpus callosum and hippocampus

3 討 論

3.1 慢性腦缺血模型大鼠學習記憶障礙與胼胝體、海馬腦區(qū)白質神經纖維及微結構破壞有關

慢性腦缺血所致VCI會出現(xiàn)學習記憶功能下降和日常生活活動能力減退等癥狀［12-13］。本研究Morris水迷宮結果顯示，與假手術組比較，術后28 d組、術后56 d組大鼠逃避潛伏期均明顯延長，穿越平臺次數和目標象限時間占比均明顯減少，提示慢性腦缺血模型大鼠出現(xiàn)學習記憶功能障礙。這與FANG等［9-11，14］研究結果一致。

白質纖維完整性的喪失是慢性腦缺血所致腦損傷的突出病理特征［15-16］。既往研究發(fā)現(xiàn)，DTI參數變化（FA、MD）是能夠反映白質神經纖維的影像學指標，輕度認知障礙患者胼胝體、穹隆等腦區(qū)FA、MD發(fā)生明顯變化［17-18］，胼胝體作為溝通兩側半球的重要信息通道，其功能降低會直接影響雙側海馬腦區(qū)的信息交流［19-20］。本研究結果顯示，與假手術組比較，術后28 d組、術后56 d組大鼠胼胝體、海馬腦區(qū)MD值均明顯下降；雙側胼胝體和雙側海馬腦區(qū)MD值均與穿越平臺次數呈正相關關系。這提示慢性腦缺血模型大鼠學習記憶障礙與胼胝體、海馬腦區(qū)白質神經纖維破壞有關。此外，本研究結果顯示，與假手術組比較，術后28 d組、術后56 d組大鼠胼胝體、海馬腦區(qū)FA值差異均無統(tǒng)計學意義。這可能是由于體素中交叉纖維的存在導致各向異性降低，限制了FA檢測白質神經纖維損傷的能力。這與既往研究發(fā)現(xiàn)海馬腦區(qū)和胼胝體內的微結構改變可以預測認知功能的恢復情況，MD是相對于FA更可靠的檢測微結構變化參數的觀點相似［21］。

本研究采用LFB染色法和免疫印跡法驗證慢性腦缺血對白質神經纖維微結構損傷的影響。研究結果顯示，慢性腦缺血會導致胼胝體白質神經纖維結構紊亂，髓鞘排列疏松，隨著時間進展，出現(xiàn)白質神經纖維松解和空泡，胼胝體和海馬腦區(qū)中髓鞘堿性蛋白的減少。這提示慢性腦缺血導致白質纖維完整性發(fā)生改變與學習記憶功能下降密切相關。這與既往研究結果一致［12］。

3.2 PDGFR-β可能是反映慢性腦缺血模型大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)白質神經纖維破壞的關鍵分子

本研究結果顯示，與假手術組比較，術后28 d組胼胝體PDGFR-β明顯升高，術后28 d組、術后56 d組海馬腦區(qū)PDGFR-β均明顯降低；與術后28 d組比較，術后56 d組胼胝體PDGFR-β明顯降低，海馬腦區(qū)PDGFR-β雖有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義。這提示PDGFR-β可能是反映慢性腦缺血模型大鼠胼胝體和海馬腦區(qū)白質神經纖維破壞的關鍵分子。這可能與以下因素有關：① 當出現(xiàn)慢性腦缺血時，胼胝體會出現(xiàn)應激反應，術后28 d組胼胝體PDGFR-β應激性增加。這與既往研究發(fā)現(xiàn)“PDGFR-β在腦缺血應激性增加”的結果一致［22］。② PDGFRβ蛋白是周細胞重要的標志物，周細胞體數量和PDGFR-β反應性存在強相關性［23］。周細胞作為血腦屏障和中樞神經系統(tǒng)毛細血管的重要組成部分，在調節(jié)腦血流低灌注和白質微結構的關聯(lián)中起著重要作用［24-25］。

4 小 結

慢性腦缺血會導致胼胝體和海馬腦區(qū)白質神經纖維結構損傷，其中胼胝體PDGFR-β變化可能是預測慢性腦缺血所致認知障礙的關鍵靶標，這將有助于闡明VCI病情進展的相關神經機制。但本研究仍存在一些局限性：① 實驗對象僅涉及慢性腦缺血大鼠，嚙齒類動物雙側頸總結扎模型與人類VCI仍有一定差距；② 僅觀察了雙側頸總結扎大鼠造模成功后28、56 d的部分病理變化。下一步研究仍需延長觀察時間，以探討慢性腦缺血后胼胝體和海馬腦區(qū)白質神經纖維結構損傷的連續(xù)性變化情況，為VCI治療最佳時機選擇相關研究奠定基礎。