王瑞，郝井志，劉曉琳

1.延安大學咸陽醫(yī)院檢驗科，陜西 咸陽 712000；2.延安大學咸陽醫(yī)院腦血管病研究所，陜西 咸陽 712000

尿源性膿毒血癥是泌尿系結(jié)石術后嚴重并發(fā)癥[1-2]。據(jù)報道，經(jīng)皮腎鏡術后尿源性膿毒血癥發(fā)生率女性為10.9%，男性為1.4%，且其病死率高達30.0%～40.0%，若未予以及時有效干預，隨病情發(fā)展可演變?yōu)楦腥拘孕菘?，威脅患者生命安全[3-4]。因此，早期篩查與預防尤為必要。目前臨床診斷尿源性膿毒血癥主要通過體溫變化、心律失常、血常規(guī)等，雖具有一定預防指導意義，但其無法明確病情發(fā)展程度，不利于實施個性化治療方案[5]。近年來，相關研究認為，尿源性膿毒血癥是一個復雜、多階段且動態(tài)的綜合征癥狀，其病理機制涉及復雜的全身炎癥網(wǎng)絡效應、免疫功能障礙、組織損傷及宿主對感染的反應等諸多方面[6-8]。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)主要包括淋巴細胞和單核細胞等，是機體抵抗感染的重要免疫細胞類型。而Toll樣受體(toll like receptors，TLRs)不僅是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫、特異性免疫的橋梁，是機體抗感染與損傷的第一道防線，表達于PBMCs表面，發(fā)生感染時TLR2 mRNA、TLR4 mRNA可迅速被激活，并能調(diào)控PBMCs對感染的應答過程，在免疫性炎癥疾病中起著重要作用，因此推測PBMCs表面TLR2 mRNA、TLR4 mRNA與泌尿系結(jié)石患者術后并發(fā)尿源性膿毒血癥有關，但現(xiàn)階段關于這方面的研究鮮見[9]。為此，本研究嘗試探討外周血單個核細胞TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達與泌尿系結(jié)石患者術后并發(fā)尿源性膿毒血癥的關系，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月至2021年4月延安大學咸陽醫(yī)院收治的59例泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥患者(觀察組)、59例泌尿系結(jié)石術后單純泌尿系感染患者(對照B組)、59例泌尿系結(jié)石術后無泌尿系感染患者(對照A組)進行前瞻性研究。觀察組患者中普通尿源性膿毒血癥26例、嚴重尿源性膿毒血癥22例和感染性休克11例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

1.2 .1 單純泌尿系感染診斷標準[10]泌尿系結(jié)石術后，尿常規(guī)檢查見大量的白細胞甚至膿球，尿液細菌培養(yǎng)檢出細菌菌株。

1.2 .2 尿源性膿毒血癥的診斷標準(1)泌尿系結(jié)石術后，尿常規(guī)檢查見大量的白細胞甚至膿球，尿液細菌培養(yǎng)檢出細菌菌株。(2)滿足以下≥2項：A，心率＞各年齡組正常平均值2個標準差；B，體溫＜36℃或＞38℃；C，呼吸頻率＞各年齡組正常平均值2個標準差或需機械通氣；D，血白細胞＞12×109/L或＜4×109/L，或桿狀核細胞＞10%，且出現(xiàn)威脅生命的器官功能障礙，如意識改變、呼吸頻率≥22次/min、收縮壓≤100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)等。

1.2 .3 尿源性膿毒血癥病情評估(1)普通尿源性膿毒血癥：①泌尿系結(jié)石術后，尿常規(guī)檢查見大量的白細胞甚至膿球，尿液細菌培養(yǎng)檢出細菌菌株。②滿足以下≥2項：A，心率＞各年齡組正常平均值2個標準差；B，體溫＜36℃或＞38℃；C，呼吸頻率＞各年齡組正常平均值2個標準差或需機械通氣；D，血白細胞＞12×109/L或＜4×109/L，或桿狀核細胞＞10%，且出現(xiàn)威脅生命的器官功能障礙，如意識改變、呼吸頻率≥22次/min、收縮壓≤100 mmHg等。(2)嚴重尿源性膿毒血癥：在普通尿源性膿毒血癥基礎上，出現(xiàn)急性器官功能衰竭(滿足至少1項)：①腦(精神癥狀)，煩躁、嗜睡、昏迷、意識混亂；②血小板＜80 000/μL或3 d內(nèi)降低＞50%；③心臟、循環(huán)系統(tǒng)，平均動脈壓≤70 mmHg或動脈收縮壓≤90 mmHg；④代謝酸中毒，剩余堿≥5 mmol/L或血pH≤7.30或血乳酸根≥正常1.5倍；⑤肺，氧化指數(shù)≤250或動脈氧分壓≤75 mmHg；⑥腎，尿量＜0.5 mL/(kg·h)。(3)感染性休克：在嚴重尿源性膿毒血癥基礎上，需血管活性藥物維持收縮壓＞90 mmHg或平均動脈壓＞65 mmHg或收縮壓≤90 mmHg至少1 h，出現(xiàn)補充容量不能糾正的低血壓[11]。

1.3 納排標準(1)納入標準：①各組符合以上對應的尿源性膿毒血癥、單純泌尿系感染診斷標準；②對照A組為泌尿系結(jié)石術后無泌尿系感染患者；③均符合泌尿系結(jié)石術指征。(2)排除標準：①入院前近7 d內(nèi)有抗菌藥物治療史者；②泌尿系結(jié)石術前明確感染者；③阿爾茨海默癥、老年癡呆或精神行為異常者；④其余慢性疾病或惡性疾病者。

1.4 檢測方法

1.4 .1 主要試劑儀器降鈣素原(procalcitonin，PCT)試劑盒購自上海透景生命科技股份有限公司；C-反應蛋白(C-reactionprotein，CRP)試劑盒購自北京森美?？爽斏锟萍加邢薰荆籘rizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)；全自動免疫發(fā)光儀(雅培i2000)；血細胞分析儀(美國貝克曼-庫爾特公司的HMX型)；實時熒光PCR儀(美國ABI公司PE-7900HT型)。

1.4 .2 經(jīng)典炎癥標志物檢測于確診后(術后3 d內(nèi))取9 mL肘靜脈血，采用血細胞分析儀測定白細胞(white blood cell，WBC)；采用化學發(fā)光免疫法檢測血清PCT水平，采用免疫比濁法檢測血清CRP水平。

1.4 .3 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA檢測取上述所采集的血標本2 mL，采用密度梯度離心法分離人PBMCs，加入2 mL Hank’s液混勻，沿食管壁緩慢加入到2 mL分離液中，2 000 r/min離心20 min，小心吸取灰白色層的單個核細胞，置于另一離心管中，用5倍體積的Hank’s液將所獲得的PBMCs懸液洗滌2次，1 500 r/min離心5 min，計數(shù)細胞，調(diào)整為5×109個/L。Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物實施聚合酶鏈反應(PCR)擴增。各基因引物序列及其產(chǎn)物見表1?；旌衔锍浞只靹蚝?，置于PCR儀中擴增，反應條件依次為：TLR2，95℃變性5 min，95℃30 s，退火60℃30 s，72℃30 s，循環(huán)35次，72℃延伸10 min；TLR4，95℃變性5 min，95℃30 s，退火50℃30 s，72℃30 s，循環(huán)30次，72℃延伸10 min。實施瓊脂糖凝膠電泳、上樣，凝膠成像，采用凝膠圖像分析軟件定量，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達量以相對內(nèi)參表示，見表1。

表1 各基因引物序列及其產(chǎn)物

1.5 統(tǒng)計學方法應用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例數(shù)描述，采用χ2檢驗；計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；TLR2 mRNA、TLR4 mRNA與經(jīng)典炎癥標志物的相關性采用Spearman分析；并發(fā)尿源性膿毒血癥的相關影響因素采用多因素Logistic回歸分析；TLR2 mRNA、TLR4 mRNA對尿源性膿毒血癥的診斷價值采用受試者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線，獲取曲線下面積(AUC)、置信區(qū)間、敏感度、特異度及Cut-off值。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者的一般資料比較三組患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、手術方式、結(jié)石類型比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 三組患者的一般資料比較[±s，例(%)]

表2 三組患者的一般資料比較[±s，例(%)]

觀察指標年齡(歲)性別(男/女)體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)手術方式經(jīng)皮腎鏡取石輸尿管軟鏡鈥激光碎石輸尿管鏡下氣壓彈道碎石結(jié)石類型腎結(jié)石尿路結(jié)石觀察組(n=59)59.77±6.03 35(59.32)/24(40.68)22.37±1.98 24(40.68)23(38.98)12(20.34)28(47.46)31(52.54)對照B組(n=59)60.08±5.86 38(64.41)/21(35.59)22.42±2.04 23(38.98)26(44.07)10(16.95)27(45.76)32(54.24)對照A組(n=59)59.83±5.95 34(57.63)/25(42.37)22.35±1.92 27(45.76)21(35.59)11(18.64)30(50.85)29(49.15)F/χ2值0.045 0.614 0.020 1.076 0.317 P值0.956 0.736 0.981 0.898 0.854

2.2三組患者的血清PCT、CRP、WBC和TLR2 mRNA、TLR4 mRNA比較觀察組患者的PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA明顯高于對照B組、對照A組，且對照B組患者的PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA明顯高于對照A組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 三組患者的血清PCT、CRP、WBC和TLR2 mRNA、TLR4 mRNA比較(±s)

表3 三組患者的血清PCT、CRP、WBC和TLR2 mRNA、TLR4 mRNA比較(±s)

注：與觀察組比較，aP＜0.05；與對照B組比較，bP＜0.05。

觀察指標PCT(μg/L)CRP(mg/L)WBC(×109/L)TLR2 mRNA TLR4 mRNA觀察組(n=59)5.89±1.15 35.59±5.62 14.35±3.52 5.68±1.24 3.94±1.01對照B組(n=59)0.61±0.13a 12.45±3.78a 12.94±1.87a 2.34±0.50a 1.26±0.33a對照A組(n=59)0.14±0.05ab 7.25±2.16ab 8.62±1.33ab 1.06±0.15ab 0.97±0.18ab F/χ2值1 344.566 797.153 89.360 556.369 408.626 P值0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

2.3 觀察組不同病情患者的一般資料比較觀察組不同病情患者的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、手術方式、結(jié)石類型比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表4。

表4 觀察組不同病情患者的一般資料比較[±s，例(%)]

表4 觀察組不同病情患者的一般資料比較[±s，例(%)]

觀察指標年齡(歲)男/女體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)手術方式經(jīng)皮腎鏡取石輸尿管軟鏡鈥激光碎石輸尿管鏡下氣壓彈道碎石結(jié)石類型腎結(jié)石尿路結(jié)石普通尿源性膿毒血癥(n=26)59.43±8.19 16(61.54)/10(38.46)22.45±2.20 10(38.46)9(34.62)7(26.92)11(42.31)15(57.69)嚴重尿源性膿毒血癥(n=22)60.26±9.37 11(50.00)/11(50.00)22.29±2.13 9(40.91)8(36.36)5(22.73)10(45.45)12(54.55)感染性休克(n=11)59.59±10.01 8(72.73)/3(27.27)22.34±2.05 5(45.45)6(54.55)0 7(63.64)4(36.36)F/χ2值0.054 1.664 0.034 3.796 1.467 P值0.948 0.435 0.966 0.434 0.480

2.4 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA與經(jīng)典炎癥標志物的相關性經(jīng)Spearman分析結(jié)果顯示，TLR2 mRNA與PCT(r=0.906)、CRP(r=0.900)、WBC(r=0.897)呈 正 相 關(P＜0.05)，TLR4 mRNA與PCT(r=0.873)、CRP(r=0.933)、WBC(r=0.916)呈正相關(P＜0.05)，見圖1。

圖1 TLR2、TLR4 mRNA與經(jīng)典炎癥標志物的相關性

2.5 泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥的影響因素經(jīng)多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA均是并發(fā)尿源性膿毒血癥的相關影響因素(P＜0.05)，見表5。

表5 泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.6 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA診斷尿源性膿毒血癥的效能經(jīng)ROC分析結(jié)果顯示，TLR2 mRNA診斷并發(fā)尿源性膿毒血癥的AUC為0.829(95% CI：0.748～0.892)，高于PCT、CRP、WBC的AUC(Z=4.188，P=0.000；Z=2.696，P=0.034；Z=4.592，P=0.000)；TLR4 mRNA診斷并發(fā)尿源性膿毒血癥的AUC為0.838(95% CI：0.759～0.900)，高于PCT、CRP、WBC的AUC(Z=4.054，P=0.000；Z=2.436，P=0.045；Z=4.530，P=0.000)，見圖2、表6。

表6 各指標診斷尿源性膿毒血癥的效能

圖2 各指標診斷尿源性膿毒血癥的ROC

2.7 觀察組不同病情患者PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達比較感染性休克患者PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA高于嚴重尿源性膿毒血癥患者、普通尿源性膿毒血癥患者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；嚴重尿源性膿毒血癥患者PCT、CRP、WBC、TLR2 mRNA、TLR4 mRNA高于普通尿源性膿毒血癥患者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表7。

表7 不同病情患者PCT、CRP、WBC、TLR2、TLR4 mRNA表達比較(±s)

表7 不同病情患者PCT、CRP、WBC、TLR2、TLR4 mRNA表達比較(±s)

注：與普通尿源性膿毒血癥比較，aP＜0.05；與嚴重尿源性膿毒血癥比較，bP＜0.05。

觀察指標PCT(μg/L)CRP(mg/L)WBC(×109/L)TLR2 mRNA TLR4 mRNA普通尿源性膿毒血癥(n=26)3.64±1.03 25.14±4.84 12.01±2.76 3.59±1.03 2.11±0.98嚴重尿源性膿毒血癥(n=22)6.15±1.22 38.22±8.64 14.82±3.25 3.59±1.03 4.26±1.05a感染性休克(n=11)10.69±1.35 55.03±11.82 18.94±4.38 10.46±1.57ab 7.63±1.15ab F值142.407 56.376 17.566 127.111 110.865 P值0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

3 討論

目前臨床檢測泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥指標較多，如經(jīng)典炎癥標志物中的PCT、CRP、WBC等，但上述指標檢測敏感度、特異度差異較大，且對年齡較大患者，發(fā)生嚴重感染時WBC降低和升高表現(xiàn)不一，可能影響后續(xù)治療[12]。因此，積極探索泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥檢測的新指標是目前臨床亟需解決的難點與重點。

Toll樣受體是固有免疫系統(tǒng)中的重要模式識別受體，可對病原相關分子模式(PAMPs)與損傷相關分子模式(DAMPs)做出反應，從而成為機體抗感染與損傷的第一道防線[13-14]。TLR2作為病原微生物的PAMPs識別受體，可識別多聚糖，能快速啟動致病因子信號轉(zhuǎn)導過程，釋放大量炎性介質(zhì)，進而在抗感染免疫中發(fā)揮重要生物學作用[15-16]。同時，相關研究顯示，TLR4可識別脂多糖，激發(fā)機體炎性反應，參與免疫炎性疾病發(fā)展進程[17-18]。本研究數(shù)據(jù)表明，泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥患者TLR2 mRNA、TLR4 mRNA高于單純泌尿系感染患者、無泌尿系感染患者，提示TLR2 mRNA、TLR4 mRNA與并發(fā)尿源性膿毒血癥有關。韓冬等[19]報道，膿毒癥患者TLR2表達升高，本研究結(jié)論與之存在相似之處。泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥導致病原微生物大量增殖與入侵，引發(fā)機體抵抗力下降，產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，活化單核細胞、巨噬細胞及中性粒細胞等，生成大量白細胞介素1、腫瘤壞死因子-α等前炎性反應細胞因子，最終啟動適應性免疫，誘發(fā)炎性反應瀑布鏈，主要表現(xiàn)為TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達上調(diào)[20]。

另外，CRP、PCT、WBC是炎性標記物，可釋放多種炎癥細胞因子，加重炎癥反應[21-23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組PCT、CRP、WBC高于對照B組、對照A組，是并發(fā)尿源性膿毒血癥的相關影響因素。ROC分析顯示，PCT、CRP、WBC對并發(fā)尿源性膿毒血癥具有一定評估價值。且本研究經(jīng)Spearman相關性分析創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA與PCT、CRP、WBC均存在正相關性，提示TLR2 mRNA、TLR4 mRNA可作為炎癥標志物，可能有助于評估泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥。由于革蘭氏陰性菌是尿源性膿毒血癥形成的主要致病菌，而革蘭氏陰性菌細胞壁毒性成份LPS通過結(jié)合脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)、細胞表面可溶性分化抗原簇14(CD14)，可形成LPS-LBP-CD14復合物，進而激活TLR4通路，并通過下游髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴途徑與非MyD88依賴途徑，活化核因子κB(NF-κB)信號傳導通路，釋放大量炎性因子，從而加重機體炎癥反應，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應[24-26]。由此可見，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA可能是通過調(diào)節(jié)泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥患者體內(nèi)炎癥反應，在疾病發(fā)展中起促進作用。在以上研究基礎上，本研究通過繪制ROC曲線還發(fā)現(xiàn)，TLR2 mRNA診斷并發(fā)尿源性膿毒血癥的AUC高于PCT、CRP、WBC的AUC，提示TLR2 mRNA、TLR4 mRNA對泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥診斷價值高于常規(guī)炎癥標志物，提示早期檢測外周血單個核細胞TLR2 mRNA、TLR4 mRNA，有望為臨床診斷泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥提供有效輔助手段。

此外，本研究數(shù)據(jù)還表明，TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達越高，患者病情越嚴重，結(jié)合王玉潯等[27]、陳歐等[28]研究分析機制可能與TLR2 mRNA、TLR4 mRNA介導生成腫瘤壞死因子-α、白細胞介素1等促炎介質(zhì)，反過來進一步上調(diào)TLRs基因表達蛋白合成，進而形成正反饋，不斷放大炎癥反應，致使炎癥反應失調(diào)，最終引起感染性休克發(fā)生有關。推測抑制TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表達可能是阻斷泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥病情進展的重要原因，但具體機制仍需今后進一步論證，這也是今后的一個研究方向。

綜上所述，泌尿系結(jié)石術后并發(fā)尿源性膿毒血癥患者存在TLR2 mRNA、TLR4 mRNA升高現(xiàn)象，早期檢測上述指標可為臨床診斷、病情程度評估提供循證指導。