孔祥云，朱玉俠，韓者藝，朱疆依

1.西安市第一醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710002；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710032

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitisprimary，AIH)-原發(fā)性膽汁性膽管炎(biliary cirrhosis，PBC)重疊綜合征(overlap syndrome，OS)屬于自身免疫性肝病的常見(jiàn)類型，是指患者同時(shí)或者在疾病不同階段發(fā)生AIH、PBC兩種疾病[1]。AIH和PBC OS患者臨床癥狀表現(xiàn)不典型，病情進(jìn)展快，救治不及時(shí)可明顯增加肝硬化等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，AIH-PBC OS的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫功能紊亂、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[3]。但是目前對(duì)于AIH-PBC OS的研究多集中在臨床表現(xiàn)、病理特征、自身抗體等方面。本研究旨在探討AIH-PBC OS患者的免疫學(xué)指標(biāo)、炎癥因子特征及其與肝功能的相關(guān)性，以期為疾病治療方案優(yōu)化提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月至2021年12月西安市第一醫(yī)院收治的186例AIH-PBC OS患者作為OS組。診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：符合以下(1)(2)(3)和(4)(5)(6)中至少各2項(xiàng)：(1)抗平滑肌抗體(SMA)陽(yáng)性，或免疫球蛋白(Ig)G高于2倍參考值；(2)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)高于5倍參考值；(3)界面性肝炎為中重度；(4)特征性破壞性膽管炎；(5)抗線粒體抗體(AMA)陽(yáng)性；(6)堿性磷酸酶(ALP)高于2倍參考值或γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)超過(guò)5倍參考值。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，且為首次確診；(2)臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并病毒性肝炎、吉爾伯特綜合征等其他肝臟疾?。?2)肝毒性藥物服用史；(3)酗酒史；(4)近期激素等藥物治療史；(5)伴其他惡性疾病、血液系統(tǒng)疾病和其他器質(zhì)性疾?。?6)感染性疾病。納入同期在我院體檢的90例健康者作為對(duì)照組，對(duì)照組受檢者經(jīng)肝腎功能、血常規(guī)、影像學(xué)等檢查結(jié)果均正常。OS組中男性19例，女性167例；年齡34～72歲，平均(52.84±11.29)歲。對(duì)照組中男性11例，女性79例；年齡36～73歲，平均(53.12±11.42)歲。兩組受檢者的性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兩組受檢者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 觀察指標(biāo)與測(cè)定方法采集兩組受檢者的清晨空腹靜脈血5 mL，肝功能指標(biāo)采用日本奧林巴斯AU5800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、ALT、ALP。免疫學(xué)指標(biāo)采用美國(guó)Beckman貝克曼DxFLEX流式細(xì)胞儀測(cè)定，包括CD4+T細(xì)胞，以及CD4+T細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、輔助性T細(xì)胞17(Th17)、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)水平，計(jì)算Th17/Treg。使用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定炎癥因子水平，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素(IL)-17、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、IL-6、IL-4水平，試劑盒均購(gòu)買自武漢艾美捷科技有限公司，并計(jì)算IL-17/TGF-β、IFN-γ/IL-4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)性分析法分析患者的免疫學(xué)指標(biāo)、炎癥因子及其與肝功能的相關(guān)性，|r|＜0.3提示兩者不存在相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的肝功能指標(biāo)比較OS組患者的ALT、AST、ALP水平明顯高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組受檢者的肝功能指標(biāo)比較(±s，U/L)

表1 兩組受檢者的肝功能指標(biāo)比較(±s，U/L)

組別對(duì)照組OS組t值P值例數(shù)90 186 ALT 26.46±8.23 175.39±49.24 69.482 0.001 AST 20.35±5.76 189.58±34.09 128.473 0.001 ALP 75.40±9.12 246.73±30.28 96.421 0.001

2.2 兩組受檢者的免疫學(xué)指標(biāo)比較OS組患者的CD4+T細(xì)胞、Treg、NK細(xì)胞水平明顯低于對(duì)照組，Th17、Th17/Treg水平明顯高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組受檢者的免疫學(xué)指標(biāo)比較(±s)

表2 兩組受檢者的免疫學(xué)指標(biāo)比較(±s)

組別對(duì)照組OS組t值P值例數(shù)90 186 CD4+T細(xì)胞(%)43.29±3.19 32.45±3.59 21.382 0.001 Treg(%)5.84±1.21 1.42±1.20 7.684 0.001 Th17(%)0.56±0.19 1.17±0.26 9.491 0.001 NK細(xì)胞(%)24.56±4.74 19.84±3.77 13.283 0.001 Th17/Treg 0.10±0.03 0.82±0.31 21.392 0.001

2.3 兩組受檢者的炎癥因子水平比較OS組患者的TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-4、IL-17/TGF-β水平明顯高于對(duì)照組，TGF-β水平明顯低于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而兩組受檢者的IFN-γ/IL-4水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組受檢者的炎癥因子水平比較(±s)

表3 兩組受檢者的炎癥因子水平比較(±s)

組別對(duì)照組OS組t值P值例數(shù)90 186 TNF-α(pg/mL)795.37±92.31 876.51±143.29 31.382 0.001 IFN-γ(pg/mL)9.77±3.58 13.89±6.65 7.391 0.001 IL-17(pg/mL)11.16±3.25 20.87±4.83 9.832 0.001 TGF-β(pg/mL)18.45±3.96 10.42±3.84 7.695 0.001 IL-6(pg/mL)135.38±31.32 153.46±40.21 32.481 0.001 IL-4(pg/mL)23.47±1.59 30.04±2.35 8.683 0.001 IL-17/TGF-β 0.60±0.21 2.00±0.78 9.044 0.001 IFN-γ/IL-4 0.42±0.18 0.46±0.22 1.349 0.178

2.4 AIH-PBC OS患者的免疫學(xué)指標(biāo)和炎癥因子與肝功能的相關(guān)性AIH-PBC OS患者的肝功能指標(biāo)與Treg、TGF-β呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與Th17、Th17/Treg、TNF-α、IL-17、IL-6、IL-17/TGF-β呈正相關(guān)(P＜0.05)。而CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4與AIH-PBC OS患者的肝功能指標(biāo)無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表4。

表4 AIH-PBC OS患者的免疫學(xué)指標(biāo)和炎癥因子與肝功能的相關(guān)性

3 討論

調(diào)查顯示，約10%的AIH、PBC患者最終確診為AIH-PBC OS[5]。AIH-PBC OS病因復(fù)雜，主要表現(xiàn)為黃疸、乏力、發(fā)熱等癥狀，也有部分患者無(wú)明顯臨床癥狀，因在體檢中發(fā)現(xiàn)肝功能指標(biāo)異常后確診。目前認(rèn)為，AIH-PBC OS患者往往表現(xiàn)為膽管、肝細(xì)胞、匯管區(qū)等的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以及機(jī)體免疫功能的過(guò)度激活[6]。通過(guò)明確AIH-PBC OS患者的免疫學(xué)和炎癥因子特征及其與肝功能的相關(guān)性，可為臨床中AIH-PBC OS患者的治療提供相關(guān)依據(jù)。

ALT、AST、ALP均為常用的肝功能指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，OS組患者的ALT、AST、ALP明顯高于對(duì)照組，提示AIH-PBC OS患者存在一定的肝功能損傷。目前認(rèn)為，對(duì)于自身免疫性肝病患者，AIH患者主要表現(xiàn)為ALT、AST明顯增加，PBC患者主要表現(xiàn)為ALP的明顯增加，而OS組患者ALT、AST、ALP均明顯增加，提示OS組患者同時(shí)具有肝細(xì)胞損傷和膽管炎癥，可能使肝功能損傷更為嚴(yán)重[7]。有研究認(rèn)為，與單純AIH、PBC相比，AIH-PBC OS患者病理分級(jí)往往更為嚴(yán)重，且肝纖維化進(jìn)展進(jìn)一步加快[8]。

CD4+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞可通過(guò)影響B(tài)細(xì)胞增殖和T細(xì)胞活性，參與自身免疫調(diào)控[9]。Treg可通過(guò)抑制機(jī)體免疫的過(guò)度激活，維持機(jī)體免疫功能平衡，減輕對(duì)組織的損傷[10-11]；Treg還可通過(guò)對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的作用，影響NK細(xì)胞活性[12]。Th17細(xì)胞與多種自身免疫性疾病的發(fā)展明顯相關(guān)，并可參與肝臟纖維化和炎癥反應(yīng)進(jìn)展[13]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，OS組患者CD4+T細(xì)胞、Treg明顯低于對(duì)照組，Th17、Th17/Treg水平明顯高于對(duì)照組，這可能是由于OS組患者可由于感染等的影響導(dǎo)致機(jī)體免疫功能缺陷，促使免疫細(xì)胞對(duì)靶組織的攻擊，使T淋巴細(xì)胞分化減少，CD4+T細(xì)胞水平下降，Treg活性受到限制，免疫耐受缺失，進(jìn)而使免疫平衡向Th17方向移動(dòng)[14-15]。

炎癥因子水平的增加可使肝臟細(xì)胞能量代謝障礙，加劇肝功能損傷，其中TNF-α可促使Th17細(xì)胞的分化，并與肝纖維化明顯相關(guān)[16]。Th1細(xì)胞主要表達(dá)IFN-γ等細(xì)胞因子，可通過(guò)促使T細(xì)胞和NK細(xì)胞活化，參與至肝臟炎性損傷中。IL-17受Th17細(xì)胞調(diào)控，具有較強(qiáng)的致炎效果，研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病中，IL-17水平均明顯增加[17]。IL-6可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞酶活性，導(dǎo)致肝臟上皮細(xì)胞和小葉結(jié)構(gòu)受損，致使機(jī)體肝功能損傷進(jìn)一步加重[18]。TGF-β由Treg分泌，研究發(fā)現(xiàn)，AIH-PBC OS患者可由于Treg功能異常，使TGF-β分泌減少[19]。Th2細(xì)胞主要通過(guò)分泌IL-4等細(xì)胞因子，參與至體液免疫調(diào)控中。本研究發(fā)現(xiàn)，OS組患者TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-4、IL-17/TGF-β水平均高于對(duì)照組，TGF-β水平低于對(duì)照組，兩組患者的IFN-γ/IL-4水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示Th17/Treg失衡可能在AIH-PBC OS的進(jìn)展中發(fā)揮更為重要的作用。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，Treg、Th17、Th17/Treg、TNF-α、IL-17、TGF-β、IL-6、IL-17/TGF-β均與AIH-PBC OS患者的肝功能指標(biāo)明顯相關(guān)。這可能是由于AIH-PBC OS患者機(jī)體中巨噬細(xì)胞等的活化可促使TNF-α、TGF-β、IL-6的分泌，增強(qiáng)肝星狀細(xì)胞活性，使α-平滑肌肌動(dòng)蛋白水平以及炎癥基因表達(dá)異常增加，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟炎癥損傷、肝臟纖維化進(jìn)一步發(fā)展。Th17可在IL-6的誘導(dǎo)下促使IL-17的合成和分泌，而IL-17為促使自身免疫性肝病發(fā)生的重要活性因子，可導(dǎo)致白細(xì)胞、NK細(xì)胞等在肝臟損傷部位的聚集，加劇肝細(xì)胞免疫損傷[20]。本研究中Th17/Treg與患者肝功能損傷的相關(guān)性最高，進(jìn)一步提示Th17/Treg平衡與AIH-PBC OS患者病情進(jìn)展的相關(guān)性。

綜上所述，AIH-PBC OS患者伴有明顯的免疫功能和炎癥因子水平紊亂，Th17/Treg失衡可能參與了AIH-PBC OS患者的病情進(jìn)展，但是具體機(jī)制仍需深入分析。