丁華杰，楊紹石，李 莎，史華寧，龔 雪，王小杰

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinom, PTC)是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年上漲趨勢(shì)，已成為女性第五大常見腫瘤。PTC預(yù)后良好，局部5年生存率達(dá)95%以上，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的5年生存率約50%。此外，長(zhǎng)期隨訪中發(fā)現(xiàn)25%的PTC患者復(fù)發(fā)[1]。因此，迫切需要尋找新的腫瘤標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)PTC的發(fā)生、發(fā)展，以提高對(duì)其的診斷、治療及遠(yuǎn)期監(jiān)測(cè)。環(huán)狀RNA(circRNA)屬于非編碼RNA，通過(guò)海綿狀微小RNA和調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過(guò)程[2-3]。最新研究表明，circRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)各種信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)展[4-5]。circRNA被認(rèn)為是潛在的臨床腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物，其活性穩(wěn)定、易于提取[6-7]。有研究表明：circ_0002111、circ_0006156和circ_0137287作為臨床腫瘤標(biāo)志物，具有改善PTC患者管理的潛力[8-10]。Circ_0015278是新近發(fā)現(xiàn)的circRNA，可以抑制幾種腫瘤的進(jìn)展，包括非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌[11-12]。本文旨在探討circ_0015278對(duì)PTC的診斷價(jià)值及與臨床病理特征的關(guān)系，為其臨床診斷及預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年12月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)甲狀腺手術(shù)切除的206例PTC及癌旁組織；收集患者年齡、性別、腫瘤大小、有無(wú)甲狀腺外侵、病理性T期(pT)、病理性N期(pN)、病理性TNM期(pTNM)、輔助放射性碘治療等。篩選標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)切除的腫瘤組織及癌旁組織保存良好，可用于RNA分離，主要臨床病理資料完整。(2)術(shù)前均未接受PTC治療，均無(wú)其他惡性疾病史。

1.2 qRT-PCR法應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)PTC及癌旁組織中circ_0015278的表達(dá)。每個(gè)樣品的qRT-PCR重復(fù)檢測(cè)3次，循環(huán)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，合計(jì)40次循環(huán)。qRT-PCR中使用以下試劑盒：TRIzol試劑(美國(guó)Thermo公司)、RNase R iScript cDNA合成試劑盒(隨機(jī)引物)(美國(guó)Bio-Rad公司)、QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(德國(guó)QiaGen公司)。GAPDH作為內(nèi)控基因被分離。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算circ_0015278的相對(duì)表達(dá)。circ_0015278正向引物：5′-TGGCTGTGGCTGTGTTAGG-3′，反向引物：5′-TTCATT GGTCTGTGGATCATATCG-3′；GAPDH正向引物：5′-GACCA CAGTCCATGCCATCAC-3′，反向引物：5′-ACGCCTGCTTCAC CACCTT-3′。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征206例PTC患者中，男性50例(24.3%)，女性156例(75.7%)；平均年齡(43.9±11.3)歲。腫瘤平均最大徑為(3.5±1.6) cm，84例(40.8%)有甲狀腺外侵，122例(59.2%)無(wú)甲狀腺外侵。pT1期29例(14.1%)，pT2期62例(30.1%)，pT3期55例(26.7%)，pT4期60例(29.1%)。pN0期69例(33.5%)，pN1期137例(66.5%)。pTNM分期：Ⅰ期111例(53.9%)，Ⅱ期16例(7.8%)，Ⅲ期47例(22.8%)，Ⅳ期32例(15.5%)。此外，57例(27.7%)患者接受了放射性碘的輔助治療。

2.2 PTC組織中circ_0015278的表達(dá)與癌旁組織[1.001(0.750，1.358)]相比，PTC組織中circ_0015278的表達(dá)降低[0.342(0.222，0.573)](Z=-14.146，P<0.001，圖1)；ROC生存曲線分析顯示，circ_0015278的表達(dá)以0.740為截?cái)嘀禃r(shí)，在鑒別PTC和癌旁組織之間具有良好的價(jià)值(AUC：0.903，95%CI：0.847～0.932，圖2)。

圖1 PTC及癌旁組織中circ_0015278的表達(dá)

圖2 PTC及癌旁組織中circ_0015278的表達(dá)ROC曲線

2.3 PTC中circ_0015278表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系PTC組織中circ_0015278高表達(dá)與患者年齡<45歲(b=-0.147，P=0.021)、無(wú)甲狀腺外侵(b=-0.134，P=0.036)、低pT分期(b=-0.165，P=0.005)、低pN分期(b=-0.192，P=0.003)和低pTNM分期(b=-0.181，P=0.002)相關(guān)。未發(fā)現(xiàn)circ_0015278表達(dá)與患者性別(b=0.053，P=0.404)及腫瘤最大徑(b=-0.100，P=0.117)相關(guān)(表1)。

表1 PTC中circ_0015278表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

circRNA作為特殊的非編碼RNA，具有數(shù)量眾多、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及高度保守等特征，能充當(dāng)微小RNA(microRNA, miRNA)分子海綿、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、剪接及參加蛋白質(zhì)的翻譯等。近年研究表明，circRNA作為miRNA海綿通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA活性，從而降低miRNA結(jié)合和下調(diào)蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本的能力[13-15]，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等重要生物學(xué)功能，成為近年關(guān)注的熱點(diǎn)[16]。有研究表明：circ_100290通過(guò)miR-29b調(diào)控CDK6的表達(dá)，促進(jìn)口腔癌細(xì)胞增殖。circ_0052112作為miR-125a-5p的分子海綿，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲。circ_PSMC3通過(guò)miR-296-5p海綿，抑制胃癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[17-19]。李瑩等[20]報(bào)道m(xù)iR-133在甲狀腺濾泡性癌(follicular thyroid carcinoma， FTC)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且與FTC高分期具有相關(guān)性，提示miR-133在FTC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，miR-133在FTC、PTC及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴腺瘤中的表達(dá)差異有顯著性。最近研究也發(fā)現(xiàn)circRNAs異常表達(dá)與PTC進(jìn)展有關(guān)[21]，測(cè)序分析表明PTC中hsa_circ_0001681(circRNA RAPGEF5或circRNA GEF5)的表達(dá)異常增加[22-24]。

近年甲狀腺癌的發(fā)病率及復(fù)發(fā)率迅速增加，盡管臨床治療技術(shù)不斷進(jìn)步，但仍然有較高的發(fā)病率及復(fù)發(fā)率[25]。circ_0015278是新發(fā)現(xiàn)的circRNA，可以抑制多種癌癥的進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺癌中，circ_0015278過(guò)表達(dá)通過(guò)海綿狀microRNA-1228減少細(xì)胞增殖。在卵巢癌中，circ_0015278通過(guò)miR-1228/p53/EMT信號(hào)抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[11-12]。本組206例PTC組織中circ_0015278的表達(dá)較癌旁組織減少，circ_0015278高表達(dá)可能作為miR-1228的海綿，增強(qiáng)野生型p53的活性(如卵巢癌)，野生型p53是甲狀腺腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵抑制因子[26]。文獻(xiàn)報(bào)道circ_0015278的高表達(dá)，與非小細(xì)胞肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[11]。本組發(fā)現(xiàn)PTC組織中circ_0015278高表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、甲狀腺外侵、pT分期、pN分期和pTNM分期呈負(fù)相關(guān)，其中與患者年齡、甲狀腺外侵、pT分期、pN分期和pTNM分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示PTC組織中circ_0015278高表達(dá)與患者年齡<45歲、無(wú)甲狀腺外侵、較低的pT、pN及pTNM分期相關(guān)；circ_0015278表達(dá)與患者性別及腫瘤大小均無(wú)關(guān)(P>0.05)。原因如下：(1)circ_0015278可能抑制PTC生長(zhǎng)，導(dǎo)致PTC分期降低[27]。(2)circ_0015278可通過(guò)海綿狀miR-1228降低PTC細(xì)胞的EMT，與無(wú)甲狀腺外浸潤(rùn)及pN0分期有關(guān)。(3)circ_0015278可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-1228/p53/EMT信號(hào)通路抑制PTC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而抑制PTC的進(jìn)展。因此，在PTC組織中circ_0015278高表達(dá)與較低的pTNM分期相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)有下列局限性：(1)隨訪時(shí)間相對(duì)較短，circ_0015278在PTC組織中的預(yù)后價(jià)值有待進(jìn)一步分析。(2)僅考察了在PTC組織病理中circ_0015278的臨床價(jià)值，而在外周血、尿液等來(lái)源RNA的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步分析。(3)PTC組織中一些circRNAs失調(diào)，本組未涉及circ_0015278調(diào)控PTC進(jìn)展的分子機(jī)制，有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，circ_0015278在PTC組織中表達(dá)減少，其高表達(dá)與PTC患者年齡<45歲、無(wú)甲狀腺外侵及較低的pT、pN及pTNM分期相關(guān)，circ_0015278有望成為改善PTC患者治療及判定預(yù)后潛在的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物。