文英會(huì)，劉占通，王 麗，張瑩瑩

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450008)

乙酰甲喹注射液是一種人工合成的化學(xué)類(lèi)廣譜抗菌制劑，屬于喹噁啉類(lèi)藥物，又稱(chēng)痢菌凈，對(duì)革蘭氏陰性菌作用強(qiáng)，對(duì)雞大腸桿菌病、仔豬黃白痢等均有效，在獸醫(yī)臨床中應(yīng)用較廣[1-4]。喹噁啉類(lèi)藥物在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)有較大的毒性代謝物，對(duì)組織器官造成損害，因此，建立一種準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠的方法測(cè)定乙酰甲喹含量具有較為重要的意義[5,6]。

目前，測(cè)定乙酰甲喹注射液的含量主要采用非水滴定法[7]，但該方法操作步驟復(fù)雜繁瑣，容易受到人為因素和環(huán)境的影響，且該方法的專(zhuān)屬性不強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)用到的試劑高氯酸和三氯甲烷等對(duì)人體危害較大，終點(diǎn)判斷時(shí)由于顏色變化不明顯，給結(jié)果判定帶來(lái)一定困難[8,9]。本試驗(yàn)利用高效液相色譜法測(cè)定乙酰甲喹注射液的含量，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，安全可靠，對(duì)操作人員及環(huán)境危害小，適用于乙酰甲喹注射液中乙酰甲喹含量的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 試藥及試劑

乙酰甲喹注射液(規(guī)格10 mL，0.2 g，批號(hào)20191001)由河南創(chuàng)鑫生物科技有限公司提供；乙酰甲喹對(duì)照品(100 mg，批號(hào)H11-01-20001含量100%)購(gòu)自中國(guó)獸藥品監(jiān)察所；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，磷酸二氫鉀(分析純)，超純水。

1.1.2 主要儀器

高效液相色譜(Waterse 2695,美國(guó)Waters公司)；紫外分光光度計(jì)(LAMBDA35，美國(guó)珀金埃爾默公司)；超純水裝置(Milli-Q Adbantage A10，美國(guó)Millipore公司)；酸度計(jì)(S210-KY1，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))；電子分析天平(AB204-N,瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))；超聲波清洗器(KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

對(duì)照品溶液的配制：精密稱(chēng)取乙酰甲喹對(duì)照品10 mg，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

供試品溶液的配制：精密量取乙酰甲喹注射液1 mL至50 mL量瓶中，用水定容后，再?gòu)闹腥? mL到100 mL量瓶中，稀釋定容到刻度，搖勻，得到0.02 mg/mL的樣品溶液，備用。

1.2.2 檢測(cè)線(xiàn)波長(zhǎng)的選擇

精密量取0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液10 mL置于100 mL量瓶中，加水稀釋定容至刻度，搖勻后得到0.01 mg/mL的對(duì)照品溶液。用純水做空白對(duì)照，稀釋處理后的對(duì)照品溶液放入紫外分光光度計(jì)的1 cm石英吸收池中，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.2.3 色譜條件

色譜柱(Waters X-Bridge C18 150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相(甲醇∶水=40∶60)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)乙酰甲喹的理化特性，分別選取甲醇和水(40∶60)、乙腈和水(13∶87)、磷酸二氫鉀(1 g磷酸二氫鉀加400 mL的水，用三乙胺調(diào)至pH=6.0)、乙腈(80∶20)、磷酸二氫鉀(pH=4.7)和乙腈(80∶20)等四種流動(dòng)相，按照1.2.3方法測(cè)定，記錄色譜圖。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

分別精密量取0.1 mg/mL的乙酰甲喹對(duì)照品溶液5 mL、10 mL、10 mL、5 mL對(duì)應(yīng)放入100 mL、100 mL、50 mL、10 mL量瓶中，加水稀釋定容，搖勻，稀釋后分別以0.005 mg/mL、0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3方法測(cè)定，測(cè)定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取1.2.1中配制好的供試品溶液，經(jīng)過(guò)0.22 μm的濾膜后，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照1.2.3方法測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確量取乙酰甲喹對(duì)照品溶液1 mL，置于50 mL容量瓶中，用水稀釋定容后，再?gòu)闹腥? mL置于100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜，在室溫下靜置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h后測(cè)定乙酰甲喹的含量，按照1.2.3方法測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，考察該試驗(yàn)方法的穩(wěn)定性。

1.2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取乙酰甲喹對(duì)照品25 mg于25 mL量瓶中，用水稀釋定容至刻度后搖勻，做儲(chǔ)備液備用。精密量取6份乙酰甲喹注射液0.5 mL置于50 mL量瓶中，再精密量取儲(chǔ)備液8.5 mL于上述容量瓶中。用水稀釋定容到刻度后搖勻，精密吸取5 mL到100 mL量瓶中用水稀釋定容搖勻，經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)樣10 μL，按照1.2.3方法測(cè)定，對(duì)回收率進(jìn)行考察。

2 結(jié)果

2.1 流動(dòng)相的選擇

分別選取甲醇∶水=40∶60、磷酸二氫鉀(三乙胺調(diào)至pH=6.0)∶乙腈=80∶20、磷酸二氫鉀(pH=4.7)∶乙腈=80∶20、乙腈∶水=13∶87四個(gè)流動(dòng)相，用對(duì)照品溶液上機(jī)測(cè)定，查看分離效果。最終的測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇∶水時(shí)，響應(yīng)值大，理論塔板數(shù)高，系統(tǒng)適應(yīng)性好，所以選取甲醇∶水(40∶60)為乙酰甲喹含量的流動(dòng)相，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙酰甲喹對(duì)照品在不同流動(dòng)相下的色譜圖

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

乙酰甲喹對(duì)照品的紫外吸收光譜如圖2所示，乙酰甲喹對(duì)照品一共有3個(gè)吸收峰，分別是241 nm、254 nm、371 nm，根據(jù)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇原則(吸光度的最大值)，選取最大吸收峰值處254 nm作為檢測(cè)乙酰甲喹注射液含量的波長(zhǎng)。

圖2 乙酰甲喹注射液紫外吸收光譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

以稀釋后的對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸收峰面積為縱坐標(biāo)，如圖3所示，數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后得線(xiàn)性回歸方程為y=59346x-81849，相關(guān)系數(shù)R2=0.9983，證明在該色譜條件下，乙酰甲喹在0.005～0.1 mg/mL濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖3 乙酰甲喹對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積分別為896333、900746、909908、909078、904603、897224，RSD為0.64%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

室溫下避光靜置的乙酰甲喹對(duì)照品溶液在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時(shí)上機(jī)進(jìn)樣10 μL，觀察色譜圖，計(jì)算其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.13%，結(jié)果表明，該測(cè)定方法下的乙酰甲喹注射液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

按照1.2.3方法測(cè)定結(jié)果如表1所示，樣品的回收率為94.78%～96.67%，RSD為0.82%，表明該方法測(cè)定的乙酰甲喹準(zhǔn)確度高。

表1 加樣回收率

3 討論

試驗(yàn)采用高效液相色譜法檢測(cè)乙酰甲喹注射液中乙酰甲喹的含量。將對(duì)照品稀釋處理后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描以確定其最大吸收波長(zhǎng)。紫外色譜圖顯示，在波長(zhǎng)為254 nm時(shí)，乙酰甲喹對(duì)照品出現(xiàn)最大吸收峰，因此選定該波長(zhǎng)為后續(xù)試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

配制三種不同的流動(dòng)相，在色譜條件下檢測(cè)，觀察對(duì)照品色譜圖。當(dāng)流動(dòng)相為甲醇∶水(40∶60)時(shí)，對(duì)照品響應(yīng)值最大，理論塔板數(shù)最高為2031，出峰效果好。以甲醇∶水(40∶60)流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm等為色譜條件，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)、線(xiàn)性回歸分析、重復(fù)性試驗(yàn)和加樣回收試驗(yàn)。結(jié)果表明該方法測(cè)定乙酰甲喹含量在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.14%；乙酰甲喹在0.005～0.1 mg/mL濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好；重復(fù)性測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.64%，精密度較高；加樣回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.82%，準(zhǔn)確度較高。

原標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的高氯酸滴定法，要求試驗(yàn)條件比較苛刻，滴定時(shí)必須在非水條件下進(jìn)行。試驗(yàn)中需用三氯甲烷進(jìn)行萃取，操作繁瑣且該試劑毒性大；同時(shí)，萃取時(shí)間不同、力度不同，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均有一定的影響。弱堿性物質(zhì)及鹽類(lèi)均可以與高氯酸反應(yīng)，所以方法的專(zhuān)屬性不高。在高氯酸滴定法檢測(cè)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，該方法對(duì)輔料要求非常嚴(yán)格。當(dāng)使用輔料能溶于三氯甲烷而不易揮干時(shí)，影響含量測(cè)定的結(jié)果，無(wú)法滴定終點(diǎn)。本研究采用水為溶劑，不但減少了有毒試劑的使用，操作簡(jiǎn)便，專(zhuān)屬性強(qiáng)，而且不受常用輔料的影響。本試驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好。