曾自珍 王利勝

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東清遠(yuǎn) 511500；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006

據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，川芎是十分常見的一種傘形科植物，根莖部分的藥用價(jià)值最高，且具有活血行氣，祛風(fēng)止痛的作用，川芎嗪別名四甲基吡嗪[1]，它主要提取自川芎根莖部分，且是其中最核心的活性生物堿，在臨床中有擴(kuò)張小動(dòng)脈、改善微循環(huán)等藥理價(jià)值[2-3]，在心腦血管、呼吸科、泌尿科等多個(gè)科室治療中都能看到其身影，尤其適用于缺血性腦血管疾病的治療[4-6]，已逐漸成為現(xiàn)在臨床中藥制劑中最有效的藥物之一。冰片能通過人體局部對(duì)藥物的吸收，引藥上行，并穿透血腦屏障[7]，并能促進(jìn)四甲基吡嗪在胃腸道的吸收[8]，多參與治療心腦血管疾病的過程中[9-10]，有一定療效。

為了使川芎嗪在腦血管疾病治療中的效果更佳，很多研究將其與其他藥物相互配合使用，進(jìn)而能夠發(fā)揮更佳的開竅醒腦、穿透血腦屏障等作用[11]。芎冰滴丸是由川芎提取物、冰片和基質(zhì)按一定比例制成的滴丸制劑。將川芎和冰片配伍制成滴丸劑型能提高生物利用度，增加穩(wěn)定性和降低刺激性等優(yōu)點(diǎn)。其有效性決定其的應(yīng)用面廣，且心腦血管產(chǎn)品的市場(chǎng)巨大，因此也會(huì)吸引企業(yè)生產(chǎn)此藥，制定其標(biāo)準(zhǔn)是十分必要的。因此，選擇芎冰滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究作為課題，使其建立明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提出量控指標(biāo)，為企業(yè)的生產(chǎn)提供檢驗(yàn)依據(jù)，從而達(dá)到有效控制其質(zhì)量的目的，實(shí)現(xiàn)此藥品的有效性與穩(wěn)定性的統(tǒng)一。

在此次研究過程中，利用薄層色譜對(duì)本品質(zhì)量進(jìn)一步管理和識(shí)別，將阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）設(shè)定為質(zhì)量控制指標(biāo)，利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法來測(cè)量和明確其在芎冰滴丸中的具體含量，然后進(jìn)一步深化與升級(jí)對(duì)其的測(cè)量方法，以明確芎冰滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國(guó)DIONEX 公司，包括P680泵、TCC-100 柱溫箱、UVD17OU 紫外檢測(cè)器和Chromeleon 液相色譜工作站），Platisil ODS 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHD-Ⅲ真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；恒溫水浴鍋（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；TGL-16B 臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AUW120D 十萬分之一分析天平（日本島津）。

1.2 藥物與試劑

FA 對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：110773-200711，供含量測(cè)定用）；川芎對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：120918-200703）；甲醇為分色譜級(jí)（天津賽孚瑞科技有限公司,批號(hào)：20090101 001）；硅膠G（青島海洋化工廠）、硅膠GF254（青島海洋化工廠）；石油醚、乙醚、環(huán)己烷、乙酸乙酯分析純；芎冰滴丸（由廣州中醫(yī)藥大學(xué)自制，規(guī)格：每丸重40 mg）

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 川芎對(duì)照品溶液 稱取1 g 川芎對(duì)照藥材，將其與50 ml 的石油醚相混合，利用超聲技術(shù)處理15 min，過濾，然后利用2 ml 的乙酸乙酯將殘?jiān)M(jìn)行溶解，得到川芎對(duì)照藥材溶液。

2.1.2 滴丸樣品溶液1 和陰性溶液 隨機(jī)選擇20 丸樣品，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備得到滴丸樣品溶液1；結(jié)合處方工藝制備出不含川芎的陰性制劑，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備得到陰性對(duì)照溶液。

2.1.3 冰片對(duì)照品溶液 稱取一定數(shù)量的冰片，乙醇溶解，得到每1 ml 中含0.5 mg 的溶液，得到冰片對(duì)照藥材溶液。

2.1.4 滴丸樣品溶液2 溶液 選取樣品50 丸，10 ml 乙醇溶解過夜，濾紙過濾，濾液作為滴丸樣品溶液2 溶液。

2.1.5 供試品溶液的制備 取1 g 樣品，將其與蒸餾水共同置于錐形瓶里，利用超聲技術(shù)對(duì)其處理5 min，過濾，放在分液漏斗中，加入乙醚振搖提取3 次，每次0.5 h，合并3 次的乙醚液后用無水硫酸鈉脫水，揮干乙醚液，利用甲醇對(duì)殘?jiān)M(jìn)行溶解，并將其重新放置在25 ml 的量瓶?jī)?nèi)，搖勻，利用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.1.6 對(duì)照品溶液的制備 精密稱量出10.60 mg 的FA，將其與甲醇混合共同放于50 ml 的量瓶?jī)?nèi)，再次與甲醇結(jié)合，搖勻，得到濃度為0.212 mg/ml 的對(duì)照品溶液。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 川芎的薄層鑒別 取川芎對(duì)照藥材溶液、滴丸樣品溶液1、川芎陰性溶液和空白基質(zhì)，采用薄層色譜法[12]進(jìn)行識(shí)別，分別取以上溶液各2～5 μl，將其點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑展開，然后將其放置于紫外光燈（波長(zhǎng)為365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照未見干擾（圖1）。

圖1 芎冰滴丸川芎薄層色譜圖

2.2.2 冰片薄層色譜鑒別 取冰片對(duì)照藥材溶液、滴丸樣品溶液2 和川芎對(duì)照藥材溶液，采用薄層色譜法[12]試驗(yàn)，將以上溶液分別吸取10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，展開劑為石油醚（30～60℃）-醋酸乙酯（17:3），展距8 cm。將其取出自然風(fēng)干，噴上5%香草醛硫酸溶液，用熱風(fēng)持續(xù)吹干，直到顯色清楚。在得出的供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)（圖2）。

圖2 芎冰滴丸冰片薄層色譜圖

2.3 含量測(cè)定的條件及優(yōu)選

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Platisil ODS 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（50∶50）；檢測(cè)波長(zhǎng)為323 nm；進(jìn)樣量10 μl；柱溫35℃。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取“2.1.6”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.l、0.4、1.2、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，以FA 濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計(jì)算，得回歸方程為：A=0.8249C+0.5818，R2=0.9992。結(jié)果表明FA 在2.12～106.00 μg/ml 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（圖3）。當(dāng)FA濃度分別為 2.12、8.48、25.44、42.40、63.60、84.80、106.00 μg/ml 時(shí)，峰面積平均積分值分別對(duì)應(yīng)1.989、6.980、21.877、35.499、54.374、71.277、86.626 mAUmin。

圖3 FA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 結(jié)合處方工藝制備不包括川芎的陰性制劑，結(jié)合供試品溶液的操作流程來進(jìn)行陰性樣品的制備，相同色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，在與FA 相應(yīng)的峰位處沒有吸收峰出現(xiàn)，結(jié)果為其他藥材對(duì)FA 的含量測(cè)定沒有影響，專屬性良好（圖4）。

圖4 芎冰滴丸的HPLC 圖譜

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精準(zhǔn)吸取對(duì)照品溶液10 μl，將其放置于液相色譜儀內(nèi)，對(duì)其定峰面積進(jìn)行測(cè)量，連重復(fù)操作5 次，最終得出RSD=1.78%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精準(zhǔn)稱量5 份樣品，每份重量為1 g，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備得到供試品溶液，分別吸取10 μl，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，同樣對(duì)其面積進(jìn)行測(cè)量，最終得出FA 的均量為0.975 mg/g，RSD=2.31%，重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 取樣品5 份，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備得到供試品溶液，利用加樣回收法，分別加入2 ml 的對(duì)照品溶液，精密吸取10 μl，將其注入高效液相色譜儀，計(jì)算回收率，結(jié)果RSD=2.27%。

2.3.7 指標(biāo)成分的選擇 作為方中君藥之一，其最關(guān)鍵的成分就是酚性成分FA、揮發(fā)油類藁本內(nèi)酯等。作為主要有效成分的FA 能明顯擴(kuò)張冠脈，增加冠脈血流量，改善心肌供氧狀況；抑制大腦皮層活動(dòng)，抑制醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)等作用[13]。所以把FA 作為質(zhì)量控制的指標(biāo)，采用HPLC 法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

2.3.8 供試品中FA 的含量測(cè)定 按照“2.1.5”項(xiàng)下方法制備3 批樣品的供試品溶液，精密吸取10 μl，注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，計(jì)算3 批樣品中FA 的含量。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果暫定本品每丸含川芎以FA（C10H10O4）計(jì)，不得少于0.03 mg。

2.3.9 川芎藥材中FA 含量測(cè)定 根據(jù)趙奎君[6]的研究，因產(chǎn)地的不同，川芎質(zhì)量差異較大，為了有效控制原料質(zhì)量，同時(shí)避免盲目投料，經(jīng)對(duì)藥材的含量測(cè)定和比較，優(yōu)質(zhì)藥材中FA 含量均大于0.4 mg/g，所以暫定投料川芎藥材中FA 的含量限度為不低于0.4 mg/g。

3 討論

在最近幾年中，隨著藥理學(xué)的進(jìn)步以及醫(yī)學(xué)研究的深入，使得中藥滴丸劑在原有的基質(zhì)與冷凝劑前提下進(jìn)行了多次優(yōu)化與升級(jí)。聚乙二醇類聚合物（PEG類）自身是沒有任何生理作用的[14]，而且極易溶于水中，進(jìn)而可以促進(jìn)藥物更好融化，另外還能幫助患者進(jìn)一步吸收。但是通過試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，盡管PEG4000 有極強(qiáng)的成型性，但是硬度有限，而PEG6000 則正好與之相反，所以在制備滴丸時(shí)將二者按一定比例混合共同作為滴丸劑的基質(zhì)。通過多次試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，將上述兩者根據(jù)1∶3 比例進(jìn)行結(jié)合，來作為滴丸劑的基質(zhì)，其整體效果會(huì)更佳。

再進(jìn)一步探討滴丸工藝的同時(shí)，計(jì)劃利用拖尾、黏連等相關(guān)指標(biāo)對(duì)其展開評(píng)估。結(jié)果通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同滴制條件下滴丸的溶散時(shí)限相差不大，均在3～10 min，無顯著性差異，故只采用滴丸硬度、圓整度、拖尾、粘連為指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)[15]。采用最有效的制備方式來對(duì)滴丸樣品評(píng)價(jià)，最終結(jié)果表明這些樣品的溶散時(shí)限都能達(dá)標(biāo)，且溶散時(shí)限幾乎都在3～8 min，這就代表滴丸的質(zhì)量是可靠的；而滴丸外觀硬度、圓整度等同樣也可以為其質(zhì)量評(píng)估發(fā)揮重要作用。

方中FA 進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，剛開始時(shí)未采用乙醚除雜，直接用乙醚提取有效成分，結(jié)果注入液相色譜儀后發(fā)現(xiàn)樣品中雜質(zhì)較多，F(xiàn)A 色譜峰有干擾，且基線漂移積分不準(zhǔn)，故在提取有效成分用乙醚進(jìn)行除雜處理，結(jié)果經(jīng)過除雜后，F(xiàn)A 色譜峰沒有干擾，陽性結(jié)果較好，基線平穩(wěn)，故采用乙醚萃取處理法處理。

當(dāng)前，很多學(xué)者就川芎中涉及FA 成分等內(nèi)容進(jìn)行過多次研究，且均使用的是HPLC、毛細(xì)管電泳法等[16-18]。筆者在本研究過程中，利用HPLC 對(duì)其含量進(jìn)行了精準(zhǔn)測(cè)定，并參考有關(guān)學(xué)術(shù)資料[19]流動(dòng)相采用酸性溶劑時(shí)FA 的分離度好，參照文獻(xiàn)[20]經(jīng)實(shí)驗(yàn)后表明，采用甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50）為流動(dòng)相，對(duì)樣品中FA 分離度均較好，出峰時(shí)間大約為10 min。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的薄層和含量測(cè)定方法，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好?？勺鳛檐罕瓮璧馁|(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。