宋汝浩 ，胡瑞芹 ，李根芳 ，張智聰 ，許強華 ,

1. 上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306

2. 大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室，上海 201306

3. 國家海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心，上海 201306

4. 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室/水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306

氧氣 (O2) 是生物體生命過程中不可或缺的重要因子。水中溶解氧 (Dissolved oxygen, DO) 是影響魚類生存的關鍵環(huán)境因素之一，影響著魚類的生長發(fā)育、新陳代謝、繁殖等生命過程[1-3]。正常狀況下，水中DO質(zhì)量濃度為6.5～7.0 mg·L?1。當水中DO質(zhì)量濃度低于2.0 mg·L?1時，常認定為低氧或缺氧狀態(tài)[4-5]。氧分子是真核細胞線粒體內(nèi)有氧供能的終端電子受體，氧含量的減少會抑制細胞內(nèi)的能量產(chǎn)生，使活性氧 (ROS) 在細胞內(nèi)大量累積而對細胞和機體造成傷害[6]。過強、持續(xù)時間過長的低氧刺激會打破生物體與環(huán)境之間的平衡，對機體產(chǎn)生危害；但輕度、較短時間的低氧脅迫可以增強生物體對低氧環(huán)境的耐受力。

鐵 (Fe) 是生命活動必需的微量元素之一。機體內(nèi)60%～75%的鐵用于血紅蛋白的合成，同時DNA合成、氧氣運輸、電子轉移、能量和物質(zhì)代謝、清除活性氧、解毒等重要生命過程中也都需要含鐵的蛋白[7-10]。鐵代謝與氧代謝的關系密不可分。氧氣的運輸主要依靠血液內(nèi)血紅蛋白中血紅素鐵與氧結合；線粒體呼吸鏈氧化磷酸化電子傳遞中涉及到的酶復合體的活性中心均與鐵元素有關，而氧恰恰又是呼吸鏈中電子的最終受體[11-12]。低氧可通過多種途徑影響鐵穩(wěn)態(tài)，而鐵代謝過程中的多種重要蛋白直接影響氧氣在機體中的運輸與利用，因此，鐵代謝與氧代謝相互調(diào)控。

多數(shù)魚類為適應低氧環(huán)境，在漫長的進化中已發(fā)展出多種策略，包括調(diào)節(jié)紅細胞增殖、抑制紅細胞凋亡、刺激血管生成等來增加氧氣輸送；以及通過降低代謝效率、減少消耗能量等生物合成途徑來減少機體耗氧量等[13]。而肝臟作為全身新陳代謝的樞紐，其功能包括調(diào)節(jié)碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝、膽汁合成、造血凝血及解毒等[14]。另外，肝臟是機體最敏感的組織之一，在應對外界刺激時，肝臟反應較早，通常容易出現(xiàn)損傷。如低氧脅迫嚴重時，魚類肝臟會處于超負荷狀態(tài)[15]。因此，在魚類應對急性低氧脅迫時，肝臟組織的代謝狀況備受關注，推測肝臟可能在低氧適應中起著重要作用。

為探究參與低氧脅迫相關的重要信號通路，以及低氧脅迫過程中鐵代謝的調(diào)節(jié)情況，本研究針對低氧脅迫后的斑馬魚 (Danio rerio) 肝臟進行轉錄組分析，并進行體外細胞實驗驗證，進一步挖掘魚類的低氧適應機制，為水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類低氧適應信號通路研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本低氧處理

實驗樣本為大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室 (以下簡稱本實驗室) 培育多代的野生型斑馬魚 (WT)，在水溫28 ℃、水中DO質(zhì)量濃度為6.7 mg·L?1的室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)。以活體豐年蟲為餌料，在每日8:00與19:00分2次喂食。

將斑馬魚從常氧質(zhì)量濃度6.7 mg·L?1開始，以1.0 mg·L?1為遞減單位進行梯度低氧處理，觀察其狀態(tài)。斑馬魚在DO質(zhì)量濃度為2.0 mg·L?1時出現(xiàn)浮頭現(xiàn)象，DO質(zhì)量濃度低于1.0 mg·L?1后則容易出現(xiàn)低氧昏迷。最終，本實驗選定1.5 mg·L?1作為低氧脅迫DO質(zhì)量濃度設定值，既滿足低氧脅迫條件又保證魚的存活。

從實驗室的野生型斑馬魚中，挑選1月齡、健康有活力的魚70尾，分成兩組，每組35尾，分別放在小型魚低氧養(yǎng)殖箱 (1.5 mg·L?1) (長沙華曉電子科技有限公司定制) 和室內(nèi)常氧循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖。利用手持溶氧儀測得室內(nèi)常氧循環(huán)水系統(tǒng)中的DO質(zhì)量濃度為6.7 mg·L?1。通過向低氧養(yǎng)殖箱中充入氮氣 (N2) 來實現(xiàn)低氧條件，在儀器上將DO質(zhì)量濃度設定為1.5 mg·L?1，當水中DO質(zhì)量濃度高于1.5 mg·L?1時就會間歇性向低氧培養(yǎng)箱中充入N2。

本實驗從斑馬魚1月齡開始進行低氧脅迫，直至成體。斑馬魚3月齡性成熟，故將實驗周期設置為2個月。低氧與常氧條件下養(yǎng)殖2個月后，分別取樣。

1.2 樣品采集

1.3 肝臟組織轉錄組建庫、測序

分別提取LH2-1、LH2-2、LH2-3、LN2-1、LN2-2、LN2-3共6個肝臟組織樣本的總RNA并進行建庫測序，嚴格按照VAHTS Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for Illumina? 試劑盒說明進行后續(xù)的建庫實驗。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling 后進行 Illumina 測序，并產(chǎn)生150 bp 配對末端讀數(shù)。

1.4 轉錄組分析

使用trimmomatic軟件預處理raw data后獲取clean data。使用Tophat2將clean data與斑馬魚GRCz10基因組對比，用edgeR軟件包求差異表達基因。差異倍數(shù)大于2且P<0.05時確定為顯著差異基因。再用cuffquant與cuff Normal的方法求出各樣品的FPKM值。

使用cluster Profile軟件包對差異基因進行GO(Gene Ontology) 和KEGG富集分析，取P<0.05時富集顯著，并利用ggplot2和gheatmp作圖。

1.5 細胞培養(yǎng)及低氧脅迫

將斑馬魚肝臟(Zebrafish liver, ZFL) 細胞置于28 ℃、5% (體積分數(shù)) CO2、21% (體積分數(shù)) O2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) (常氧組)；將ZFL細胞置于28 ℃、5% (體積分數(shù)) CO2、0.1% (體積分數(shù)) O2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行低氧脅迫 (低氧組)。低氧脅迫細胞實驗顯示：低氧脅迫第2天出現(xiàn)大量細胞死亡；脅迫3～4 d后，死亡細胞數(shù)量減少；低氧脅迫5 d后，未出現(xiàn)大量細胞死亡的現(xiàn)象，故將脅迫周期設定為5 d。在實驗的第2、第3、第4和第5天，分別提取低氧組和常氧組ZFL細胞的RNA和蛋白質(zhì)。

1.6 Alamar blue法檢測細胞活力

將適量對數(shù)生長期的ZFL細胞分兩組接種于96孔板，每組4個重復孔。過夜培養(yǎng)后，分別對兩組細胞進行常氧和低氧處理，在第2、第3、第4和第5天測定細胞活力變化情況。首先在培養(yǎng)基中加入10 μL Alamar blue溶液，然后于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，使用微量酶標儀檢測其在570 nm下的吸光值。將常氧組樣品的吸光值設置為100%來計算低氧組細胞活力的變化情況?；盍y定設置3個平行。細胞活力采用公式“細胞活力=低氧組樣品的吸光值/常氧組樣品的吸光值×100%”來計算。

1.7 實時定量PCR技術 (RT-qPCR)

利用TRIzol法分別提取低氧脅迫2個月和常氧對照組斑馬魚肝臟組織的總RNA，并以1 μg總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄步驟按照北京擎科生物科技有限公司的反轉錄試劑盒GlodenstarTtMm RT6 cDNA Synthesis Mix說明書進行。對鐵代謝相關的5個基因進行RT-qPCR反應 (引物見表1)，以β-actin為內(nèi)參，采用 2?ΔΔCt法進行計算。將RT-qPCR與轉錄組測序數(shù)據(jù) (RNA-seq) 中基因的相對表達量做比較分析，并用SPSS 25.0計算兩者結果的皮爾遜相關系數(shù) (R2)，其相關性的顯著性經(jīng)過t檢驗。

南京市江寧區(qū)率先基本實現(xiàn)水利現(xiàn)代化的途徑和保障措施…………………………………… 吳玉敏，何 華，李育華(3.56)

同理，利用TRIzol法提取低氧處理3 d的ZFL細胞總RNA，并測定RNA的濃度和純度。采用2?ΔΔCt法進行計算，檢測細胞中鐵代謝相關基因表達水平的變化，相關引物設計見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡 (Western Blot, WB)

分別取低氧脅迫與常氧條件下培養(yǎng)3 d的ZFL細胞，去掉培養(yǎng)基后，向ZFL細胞培養(yǎng)皿中加入200 μL RIPA裂解液和1% PMSF (蛋白酶抑制劑)，4 ℃裂解20 min，轉移至離心管中15 000 r·min?1離心10 min。取上清，即為總蛋白溶液。利用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，之后進行蛋白分離 (12%的聚丙烯酰胺凝膠)，然后轉膜 (0.22 μm，PVDF膜，電壓100 V，轉膜60 min)，轉膜后封閉2 h (5%脫脂奶粉)，一抗4 ℃過夜孵育 (3%脫脂奶粉稀釋一抗)，清洗3次后 (western洗滌液)，二抗孵育2 h，洗滌后進行蛋白顯影，檢測低氧組與常氧組斑馬魚肝臟細胞中鐵蛋白 (Ferritin) 的表達情況。

1.9 統(tǒng)計學處理

利用GraphPad Prism 7軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，通過t檢驗檢測不同樣品間的差異性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 斑馬魚肝臟轉錄組差異基因統(tǒng)計

為探究低氧脅迫對斑馬魚肝臟基因表達的影響，對低氧脅迫2個月和常氧對照組的斑馬魚肝臟轉錄組進行分析比較。兩組間共有3 270個基因的表達量發(fā)生顯著變化。其中，低氧組中表達量上調(diào)的基因有1 864個，下調(diào)的有1 406個。表明在低氧脅迫2個月后，斑馬魚肝臟中基因的表達量發(fā)生顯著變化，使機體得以適應低氧環(huán)境。

2.2 斑馬魚肝臟組織轉錄組KEGG Pathway分析

為探究斑馬魚肝臟響應低氧脅迫的主要信號通路，對3 270個差異表達基因進行KEGG富集分析。當P<0.05時，主要富集到28條信號通路 (圖1)，包括細胞增殖相關通路 [細胞周期 (Cell cycle)、基因復制 (DNA replication)、基因錯配修復 (Mismatch repair)]、脂質(zhì)代謝相關通路 [脂肪酸代謝(Fatty acid metabolism)、過氧化物酶體 (Peroxisome)、脂肪酸降解 (Fatty acid degradation)]、糖類代謝相關通路及氨基酸代謝相關通路等。

圖1 低氧脅迫下肝臟組織KEGG Pathway富集分布Fig. 1 Enrichment distribution of KEGG Pathway in liver tissue under hypoxia stress

同時，分別對低氧脅迫后斑馬魚肝臟中表達量上調(diào)的1 864個基因和下調(diào)的1 406個基因進行KEGG分析。結果發(fā)現(xiàn)，表達量顯著上調(diào)基因富集的信號通路主要與細胞增殖相關，包括基因復制、細胞周期和同源重組 (Homologous recombination)(圖2-a)。而表達量顯著下調(diào)基因富集的差異顯著信號通路主要與脂質(zhì)代謝相關，包括脂肪酸降解和過氧化物酶體 (圖2-b)。表明斑馬魚在低氧脅迫2個月后，其肝臟細胞的增殖能力變強，而脂質(zhì)代謝相關水平下降。

圖2 低氧脅迫肝臟組織差異基因KEGG Pathway富集分布注：a. 上調(diào)基因 KEGG Pathway 富集分布；b. 下調(diào)基因 KEGG Pathway 富集分布。Fig. 2 Enrichment and distribution of differential gene KEGG Pathway in liver tissue under hypoxia stressNote: a. Up-regulated gene KEGG Pathway enrichment distribution; b. Down-regulated gene KEGG Pathway enrichment distribution.

2.3 斑馬魚肝臟組織轉錄組GO富集分析

為進一步探究低氧脅迫過程中，低氧對斑馬魚肝臟細胞增殖和脂質(zhì)代謝影響的分子機制，對低氧脅迫與常氧下的斑馬魚肝臟組織轉錄組的3 270個差異表達基因進行GO富集分析。分析結果同樣顯示，與細胞增殖 [DNA復制起始帶 (DNA replication origin banding)] 和脂質(zhì)代謝 [氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)] 相關的轉錄水平發(fā)生顯著變化。其中，鐵離子束 (Iron ion banding) 同時參與細胞增殖調(diào)控和氧化磷酸化調(diào)控 (圖3)。可以推測，斑馬魚肝臟中鐵代謝調(diào)節(jié)對其低氧適應發(fā)揮了重要作用。

圖3 低氧脅迫后肝臟GO富集分布Fig. 3 Distribution of GO enrichment in liver after hypoxia stress

2.4 低氧脅迫后斑馬魚肝臟組織中與鐵代謝相關基因的表達量分析

為探究鐵代謝在斑馬魚肝臟響應低氧脅迫中的作用，對低氧脅迫2個月和對應常氧組基因的表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)與鐵代謝相關基因的表達發(fā)生明顯變化。其中，與鐵離子儲存相關的fthl28和fthl31基因表達量的差異極顯著 (圖4)。表明鐵代謝調(diào)節(jié)在斑馬魚的肝臟組織響應低氧脅迫時發(fā)揮重要作用。另外，在篩選出的基因中選取5個基因做RT-qPCR，并與轉錄組測序數(shù)據(jù)中該基因的相對表達量做比較，發(fā)現(xiàn)兩者的表達趨勢一致，皮爾遜相關系數(shù)R2為0.946，相關性顯著 (P=0.015)，證實了轉錄組測序的有效性。

圖4 低氧脅迫后斑馬魚肝臟組織中與鐵代謝相關基因的表達量分析注：a. 鐵代謝相關基因的相對表達量熱圖；b. 5 個鐵代謝相關基因的 RT-qPCR 和 RNA-seq 相對表達量的對比分析。Fig. 4 Analysis of expression levels of genes related to iron metabolism in zebrafish liver tissues after hypoxia stressNote: a. Heat map of relative expression of iron metabolism relative genes; b. Comparative analysis of relative expression of five iron metabolism related genes of RT-qPCR and RNA-seq.

2.5 低氧脅迫造成ZFL細胞內(nèi)鐵代謝紊亂

為進一步驗證鐵代謝調(diào)節(jié)是否參與斑馬魚肝臟細胞響應低氧脅迫，利用ZFL細胞進行了體外驗證實驗。首先，通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，與常氧條件下的ZFL細胞相比，0.1%的低氧濃度下ZFL細胞脅迫3 d后出現(xiàn)大量死亡 (圖5-a)。另外，隨著低氧脅迫時間的延長，ZFL細胞的成活率顯著下降(圖5-b)。繼續(xù)低氧脅迫后，發(fā)現(xiàn)細胞存活數(shù)量在低氧脅迫5 d時未出現(xiàn)大量減少，于是將脅迫周期暫時設定為5 d。對0.1%的低氧濃度下脅迫3 d的ZFL細胞與常氧條件下ZFL細胞的鐵代謝相關基因的表達量進行定量分析，發(fā)現(xiàn)低氧脅迫條件下ZFL細胞中鐵離子代謝相關基因的表達量顯著降低(圖5-c)。低氧脅迫下ZFL細胞中鐵蛋白的表達量與常氧條件下相比明顯減少 (圖5-d)。由此推測，低氧脅迫條件下ZFL細胞內(nèi)鐵離子含量明顯減少，鐵代謝發(fā)生紊亂。

圖5 低氧脅迫ZFL細胞及細胞成活率、鐵代謝相關基因與鐵蛋白鑒定注：*. 與低氧組 (0.1% O2) 相比在 P<0.05 水平存在差異；**. 在 P<0.01 水平差異顯著；***. 在P<0.001 水平差異極顯著。a. 0.1% O2 脅迫3 d 與常氧條件下 ZFL 細胞存活量對比；b. 0.1% O2 脅迫下 ZFL 細胞活性檢測；c. 0.1% O2脅迫 3 d 與常氧條件下 ZFL 細胞中鐵代謝相關基因表達量分析；d. 0.1% O2 脅迫后鐵蛋白表達量與常氧下對比。Fig. 5 Identification of ZFL cells and cell survival rate, iron metabolism-related genes and Ferritin protein under hypoxia stressNote: *. Difference (P<0.05) compared with the hypoxia group (0.1% O2); **. Siginificant difference at P<0.01 level; ***. Very significant difference at P<0.001 level. a. Comparison of the viable cell mass of ZFL cells under 0.1% O2 stress for 3 d and normoxia condition; b. Detection of ZFL cell viability under 0.1% O2 stress; c. Analysis of the expression of genes related to iron metabolism in ZFL cells under 0.1% O2 stress for 3 d and normoxia condition; d. Comparison of Ferritin protein expression after 0.1% O2 stress and normoxia condition.

3 討論

魚類需要通過利用氧氣氧化底物所產(chǎn)生的能量來維持其正常的生存、生長、發(fā)育以及繁殖等生命活動，這要求機體必須得到持續(xù)、充足的氧氣供應。由于氧氣在水中擴散能力較弱，水環(huán)境較容易出現(xiàn)低氧脅迫的情況。因此，許多魚類已進化出一系列適應低氧脅迫的策略[16-17]。不同種類的魚在自然界中面對的低氧脅迫情況各不相同[18]。本研究通過對低氧脅迫2個月的低氧組與常氧組的斑馬魚肝臟組織進行轉錄組比較分析，發(fā)現(xiàn)了大量差異表達的基因。而相關研究人員在對海洋青鳉 (Oryzias melastigma) 的肝臟[19]及裂腹魚 (Gymnocypris eckloni) 的缺氧適應性反應[20]進行轉錄組分析時發(fā)現(xiàn)的差異基因數(shù)目均較少。本研究在實驗室可控條件下，利用模式生物斑馬魚進行肝臟轉錄組分析研究，發(fā)現(xiàn)了一系列與低氧適應相關的基因，這對魚類低氧脅迫研究具有參考意義。

在對低氧與常氧斑馬魚肝臟差異基因的KEGG信號通路分析中發(fā)現(xiàn)，顯著下調(diào)基因富集的信號通路主要與脂質(zhì)代謝相關。在對低氧脅迫雜交斑紋鱸(Morone saxatilis × M. chrysops) 的研究中發(fā)現(xiàn)，其肝臟中脂肪酸代謝和脂蛋白代謝相關基因顯著下調(diào)[21]，這與本研究結果一致。但對尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus) 短期低氧脅迫時 (6和12 h)，成魚肝臟的糖酵解/糖異生通路和脂肪酸代謝通路的相關基因表達均顯著升高[22-23]。這可能與魚類在不同時間的低氧脅迫過程中機體產(chǎn)生不同的應對機制有關。有研究表明，長期低氧脅迫時魚類主要通過脂質(zhì)分解 (Lipolysis) 為機體提供能量[24]。對尼羅羅非魚低氧脅迫4周，肝臟中糖異生和脂質(zhì)分解通路相關基因表達增加，而糖酵解和脂質(zhì)的合成通路相關基因表達減少[22]。這也充分說明脂質(zhì)代謝在低氧脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

在對低氧與常氧斑馬魚肝臟差異基因的KEGG富集通路分析中同時發(fā)現(xiàn)，顯著上調(diào)基因富集的信號通路主要與細胞增殖相關。有研究發(fā)現(xiàn)，促進細胞增殖可能會使紅細胞數(shù)量增多；而當紅細胞增多時，其體積會相應減小，通過降低血液的黏稠度來保持血液的流速，以確保氧氣的運輸效率[25]。同時也有研究指出，機體還可通過誘導與生存 [如紅細胞生成 (鐵代謝)、血管生成、葡萄糖代謝、細胞增殖]和凋亡等相關基因的表達，激活相應的低氧適應策略，來適應低氧環(huán)境[26]。對海洋青鳉的肝臟轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，缺氧會引發(fā)其肝臟應激反應，使與細胞增殖和代謝相關的多個基因表達量發(fā)生改變[19]。對軍曹魚 (Rachycentron canadum) 的研究發(fā)現(xiàn)，機體在缺氧脅迫下通過轉錄水平調(diào)控一些重要途徑來維持生理活動，如有氧代謝和厭氧代謝的轉換、能量消耗的減少、促進紅細胞增殖等，從而維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[27]。這些研究結果與本研究結果高度相關?？梢?，低氧脅迫下，機體可通過細胞增殖相關通路、脂質(zhì)代謝相關通路、糖類代謝相關通路維持正常的身體機能。

對低氧與常氧斑馬魚肝臟的轉錄組進行GO富集分析，其中鐵離子束被顯著富集。這一發(fā)現(xiàn)在以往低氧適應相關轉錄組研究中未被提及。細胞中的鐵離子同時對DNA合成、轉運、細胞周期進程、血管生成、線粒體內(nèi)鐵離子量和細胞內(nèi)鐵儲存等起著重要作用；但當細胞內(nèi)游離鐵離子過多時，也會導致脂質(zhì)過氧化等多種危害機體健康的反應過程[28]。研究人員對斑馬魚幼魚進行輕度缺氧 (5% O2) 預馴化，實驗結果顯示差異基因主要參與氧化還原、紅細胞發(fā)育和細胞鐵離子穩(wěn)態(tài)等過程[29]。這與本研究的結果相一致。因此，鐵代謝可能在斑馬魚低氧脅迫過程中，對其適應低氧起著非常重要的作用。

在對鐵離子相關基因表達量的分析中發(fā)現(xiàn)，與鐵離子儲存相關的fthl28和fthl31基因在低氧脅迫2個月時表達量顯著升高。鐵對Fe-S簇形成或血紅素合成至關重要。因此，鐵對維持線粒體呼吸鏈或檸檬酸循環(huán)至關重要，過量的游離鐵可能導致嚴重的氧化損傷，而鐵蛋白表達和鐵蛋白吞噬控制鐵儲存和釋放的不同過程。有研究表明，低氧條件下巨噬細胞通過減少細胞內(nèi)游離鐵，增加鐵蛋白表達以應對低氧脅迫[30]。fthl28和fthl31均為鐵蛋白編碼基因，因此，fthl28和fthl31在低氧脅迫下的表達發(fā)生顯著變化值得關注。對于這兩個基因在不同低氧時期的表達差異仍需進一步研究。本研究對其中與鐵代謝相關的5個基因進行RT-qPCR實驗，并與轉錄組測序數(shù)據(jù)中該基因的相對表達量作比較，發(fā)現(xiàn)兩者的基因表達趨勢一致，且皮爾遜相關系數(shù)R2大于0.7，差異顯著分析顯示P<0.05，說明了轉錄組測序結果的有效性。

本研究通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，低氧濃度下的肝臟細胞成活率下降，鐵離子代謝相關基因和蛋白的表達量也顯著降低。李海洲等[31]將培養(yǎng)的骨骼肌細胞暴露在低氧環(huán)境下(體積分數(shù)為1% O2) 0、12、24 h，結果顯示低氧對骨骼肌細胞鐵代謝的影響與暴露時間密切相關，一定時間的低氧暴露可以提高肌細胞的鐵攝取能力，降低鐵釋放，增加細胞內(nèi)的鐵含量；而長時間的低氧暴露會引起肌細胞鐵代謝紊亂。本研究對斑馬魚肝臟細胞進行體外低氧脅迫 (體積分數(shù)為0.1% O2)，發(fā)現(xiàn)低氧脅迫下ZFL細胞內(nèi)鐵蛋白 (即鐵離子含量) 明顯減少，實驗結果與上述研究一致。

綜上，低氧脅迫過程顯著影響了與細胞增殖和脂質(zhì)代謝相關的通路，同時使鐵代謝穩(wěn)態(tài)相關基因的表達發(fā)生了顯著變化。短期低氧脅迫時，斑馬魚肝臟細胞中與鐵代謝相關基因的表達量降低，細胞內(nèi)鐵蛋白減少，鐵代謝發(fā)生紊亂；而低氧脅迫2個月時，斑馬魚肝臟中與鐵代謝相關基因的表達量明顯升高，形成了新的鐵穩(wěn)態(tài)。研究表明鐵代謝調(diào)節(jié)是低氧脅迫下的重要響應過程，低氧會導致細胞內(nèi)鐵離子含量減少造成鐵代謝紊亂，延長低氧時間會形成新的鐵穩(wěn)態(tài)。鐵代謝調(diào)節(jié)作為低氧響應的重要過程，其具體響應的分子機制仍需要進一步探究。