陳 堯，陳雪冬，李前芳，宣 旭,楊巧鋒

(1.洛陽師范學院 生命科學學院，河南 洛陽 471934;2.武漢市農(nóng)業(yè)科學院 林業(yè)果樹研究所，湖北 武漢，430064)

水稻是重要的糧食作物，目前在我國的種植面積為2992萬hm2，2021年產(chǎn)量為21285萬t。水稻生產(chǎn)對于我國農(nóng)業(yè)發(fā)展，對于保障國家糧食安全“底線”至關重要[1]。自從出現(xiàn)稻米產(chǎn)能過剩的現(xiàn)象以來，水稻品種開發(fā)的目標逐漸由傳統(tǒng)高產(chǎn)育種轉(zhuǎn)為提升稻米品質(zhì)潛力，進一步生產(chǎn)營養(yǎng)、綠色、安全的稻米產(chǎn)品。表皮毛是水稻等植物莖葉組織表面的一種由表皮細胞分化而來的特化結(jié)構，主要分布在葉、莖、花等器官的表面[2]。表皮毛作為植物內(nèi)部與外界環(huán)境之間的緩沖區(qū)，可以增強植物對不利環(huán)境和機械損傷等危害的抵抗力，如散發(fā)或儲存水分、熱量以應對溫度條件的改變，減弱紫外線照射所帶來的傷害[3-4]。然而，對于水稻來說，滑葉或光葉被學術界認為是一種優(yōu)勢性狀。一方面，在水稻收割晾曬及加工過程中，表皮毛會對農(nóng)事人員和禽畜的皮膚和腸胃粘膜產(chǎn)生一定的刺激作用；另一方面，表皮毛不利于水稻的光能轉(zhuǎn)換效率[5]。目前關于水稻中表皮毛的形成機制研究較少，如何培育表皮毛較少的高品質(zhì)水稻，提高水稻副產(chǎn)品的利用價值，有待于進一步研究。植酸是一種抗營養(yǎng)物質(zhì)，是種子中磷的主要儲存形式，過量的植酸積累會損害飲食中鐵，鈣和鋅等營養(yǎng)成分的生物利用，限制養(yǎng)分的吸收，且谷物中未被有效利用的植酸鹽會排入自然環(huán)境中，對土壤和水體造成嚴重污染[6-7]。因此，如何培育低植酸水稻品系，提高稻米的營養(yǎng)價值，也是目前水稻品種遺傳改良的熱門研究領域。本研究通過分析多磷酸肌醇合成途徑中水稻多磷酸肌醇激酶基因的過量表達對植酸合成和表皮毛發(fā)育的影響，明確了磷酸肌醇代謝基因在植酸合成和調(diào)控中的功能，揭示了水稻中植酸水平與表皮毛密度之間的關系，為培育低植酸和光葉的雙性狀水稻品系提供了候選基因資源，進一步為改善水稻品質(zhì)、節(jié)約磷肥資源、助力農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論和技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究選用野生型（WT）和轉(zhuǎn)基因水稻為研究對象：野生型水稻為粳稻中花11品系（ZH11）；實驗室前期利用農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化法在野生型水稻背景下轉(zhuǎn)入CaMV35S啟動子控制的水稻多磷酸肌醇激酶基因（35S::OsIPK2），獲得過表達OsIPK2基因的2個水稻株系O1和O2。

1.2 基因表達分析

采集水稻葉片，采用液氮研磨法破碎組織。采用植物總RNA提取試劑盒（上海生工生物，B518631）提取總RNA。利用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒（TIANGEN，KR116）去除gDNA，并利用OligodT引物和逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板。利用Primer 5.0軟件設計引物，以UBQ5基因為內(nèi)參，使用RR820A-TB Green?Premix Ex TaqTMII（TaKaRa，RR820A）進行實時定量PCR擴增。

1.3 植酸含量測定

使用抗壞血酸鹽-鉬酸銨法測定游離磷酸鹽含量[8]，采用K-PHYT試劑盒進行植酸含量測定[9]。

1.4 掃描電鏡觀察

采集不同基因型種子和葉片，進行如下處理：25%戊二醛和1%鋨酸先后分別固定4 h，用磷酸緩沖液洗滌，然后依次用不同梯度濃度的酒精逐級脫水；醋酸異戊酯過渡。用HCP-2型臨界點干燥儀干燥樣品，將干燥的樣品粘在樣品臺上，然后用SBC-12型離子濺射儀進行真空噴鍍。用Phenom Pro掃描電鏡對經(jīng)過處理的樣品掃描觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)測量統(tǒng)計

采用ImageJ軟件測量表皮毛參數(shù)，使用Graphpad軟件進行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 過量表達磷酸肌醇激酶促進水稻葉片中的植酸積累

由圖1可知，通過在中花11水稻品系背景下過量表達水稻多磷酸肌醇激酶基因（OsIPK2），可以促進植酸水平的積累。野生型植株中植酸含量約為（0.35±0.04）mg·g-1，而過表達水稻株系中植酸含量分別為（0.45±0.04）mg·g-1和（0.67±0.10）mg·g-1，O1、O2相比于對照分別提高了28%、90%。植酸是植物中的重要抗營養(yǎng)物質(zhì)，多磷酸肌醇激酶是植酸合成途徑中的關鍵組分[10]。因此，轉(zhuǎn)基因水稻中過量表達多磷酸肌醇激酶使得植酸積累可能會導致稻米營養(yǎng)品質(zhì)和營養(yǎng)生長狀況的改變。

圖1 過量表達多磷酸肌醇激酶促進水稻葉片中的植酸積累

2.2 過量表達磷酸肌醇激酶促進水稻種子表皮毛發(fā)生

利用掃描電子顯微鏡觀察不同基因型水稻成熟種子的表皮毛結(jié)構，結(jié)果如圖2所示。與野生型水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻的表皮毛生長情況發(fā)生了明顯變化：轉(zhuǎn)基因水稻的表皮毛長度明顯長于野生型，且發(fā)生了明顯的彎折，其密度也高于野生型種子。利用ImageJ軟件進行統(tǒng)計結(jié)果顯示，野生型水稻的表皮毛長度為（430.4±53.62）μm，而過表達植株的表皮毛長度分別為（553±112.1）μm和（566.7±87.64）μm，O1、O2相比于野生型分別增加了27%、32%。此外，表皮毛密度統(tǒng)計結(jié)果顯示，野生型水稻種子表皮毛的密度為（15.03±1.62）個·mm-2，而植酸過量植株中種子表皮毛密度分別為（18.31±3.48）個·mm-2和（20.17±3.29）個·mm-2，O1、O2相比于野生型分別增加了22%，34%。這說明過量的植酸積累促進了種子發(fā)育過程中表皮毛的發(fā)生和伸長生長。

圖2 過量表達多磷酸肌醇激酶促進水稻種子表皮毛合成

2.3 過量表達磷酸肌醇激酶影響了水稻葉片表皮毛的密度

水稻葉片表皮毛結(jié)構多樣，主要有3種類型：長毛、微毛和腺毛。長毛主要分布在維管束的硅質(zhì)細胞上，微毛和腺毛主要分布在氣孔細胞附近。不同基因型水稻成熟葉片的表皮毛生長情況如圖3所示。ZH11品系水稻葉片的表皮毛主要包括長毛（Macro-Hair）和微毛（Micro-Hair）。電鏡視野下，植酸過量水稻的表皮毛數(shù)量明顯多于野生型。統(tǒng)計結(jié)果顯示，野生型植株的葉片微毛的密度為（34.5±10.53）個·mm-2，長毛密度為（15.67±4.21）個·mm-2；而植酸過量植株中葉片微毛的密度分別為（63.33±18.17）個·mm-2和（52.63±21.5）個·mm-2，長毛密度分別為（17.56±4.48）個·mm-2和（11.17±5.25）個·mm-2。這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)說明過量的植酸積累主要促進了水稻葉片上微毛的發(fā)育。

圖3 過量表達多磷酸肌醇激酶影響水稻葉片表皮毛的密度

2.4 水稻表皮毛發(fā)育相關基因的表達水平分析

不同基因型水稻中表皮毛發(fā)育調(diào)控因子的表達水平如圖4所示。與ZH11野生型水稻相比，植酸過量水稻中一系列表皮毛發(fā)育相關基因的表達發(fā)生顯著變化。在植酸過量水稻株系中，生長素合成途徑中的YUC1，YUC2，YUC4基因的表達水平約為野生型水稻的2.7～2.8倍，YUC5基因的表達水平?jīng)]有明顯變化；AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子HL6基因的表達水平約為野生型的7.8倍。實時定量PCR的結(jié)果說明OsIPK2的表達導致水稻表皮毛發(fā)育相關基因的表達顯著上調(diào)，因此表皮毛的發(fā)育總體受到促進。

圖4 水稻表皮毛發(fā)育相關基因的表達水平

3 結(jié)論與討論

植酸是一種最廣泛存在的磷酸肌醇分子，也是種子中磷的主要儲存形式，通過螯合礦物陽離子形成植酸鹽儲存在谷物的糊粉層中，當種子開始萌發(fā)，植酸酶會將植酸降解生成肌醇，礦物陽離子和無機磷供發(fā)育所需[11]。本研究通過在水稻中過量表達多磷酸肌醇激酶促進了水稻中植酸的生物合成，并且發(fā)現(xiàn)植酸過量積累會促進水稻種子及葉片表皮毛的形成。研究結(jié)果有助于揭示水稻植酸合成和表皮毛形成的調(diào)控機制。

水稻的莖、葉、種子等組織具有較厚的蠟質(zhì)結(jié)構，且表皮毛結(jié)構覆蓋了各組織的表面。盡管模式植物擬南芥中一系列調(diào)控表皮毛形成的關鍵因子已經(jīng)被揭示，但不同物種中的表皮毛發(fā)育機制存在較大的差異，水稻表皮毛的形成機制尚不清楚[12-15]。然而，過表達OsTCL1的轉(zhuǎn)基因水稻中的表皮毛發(fā)育和根毛的形成并不會受到影響。前人研究表明生長素信號能夠促進植物表皮細胞的生長和增殖，如AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子HL6能夠通過激活生長素合成相關基因的轉(zhuǎn)錄促進生長素的積累，進一步刺激水稻葉片上的大表皮毛細胞的發(fā)育和伸長生長[16]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻植株中YUC1，YUC2，YUC4和HL6基因的表達水平顯著高于野生型，說明水稻植酸與生長素的合成途徑有著密切的聯(lián)系，過量的植酸可能促進了水稻中生長素的合成，從而有助于表皮毛細胞的起始和伸長。

前人表明，光葉水稻品系雖然分蘗較少，但具有莖桿粗壯、光合效率較高、籽粒飽滿等特性[5]。通過分析光葉性狀與病蟲害發(fā)生之前的相關性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻病蟲害的發(fā)生主要受到抗病基因的調(diào)控，與水稻葉片表皮毛特性無關[17]。而長表皮毛的水稻品系會在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生很多灰塵，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)人員以及禽畜的眼睛、呼吸道、皮膚產(chǎn)生一定的刺激作用。因此，通過減少植酸的積累和表皮毛的形成可能有助于提高稻米的營養(yǎng)品質(zhì)，并減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的過敏現(xiàn)象。

綜上所述，本研究表明植酸的生物合成能夠促進水稻種子和葉片表皮毛的生長，而降低水稻中的植酸水平可能有助于提高稻米品質(zhì)。本研究為低植酸且光葉的水稻品系選育提供了理論參考。