路思晗，陳慧琳，仇 芬，王巍杰

（華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210）

化學(xué)肥料在我國應(yīng)用歷史悠久，使我國糧食連年增產(chǎn)，收益可觀。但隨著環(huán)境問題的日益突出，“轉(zhuǎn)方式，調(diào)結(jié)構(gòu)”的需求迫在眉睫[1]。近年來生物有機肥的興起有效解決了這一問題。生物有機肥是指特定功能微生物與主要以動植物殘體（如畜禽糞便、農(nóng)作物秸稈等）為來源并經(jīng)無害化處理、發(fā)酵腐熟的有機物料復(fù)合而成的一類兼具微生物肥料、化學(xué)肥料和有機肥效應(yīng)的肥料。

生物有機肥經(jīng)過無害化處理，安全高效無污染，且含有豐富的營養(yǎng)，可以改善土壤理化性質(zhì)[2]，活化土壤，通過增加土壤中有機質(zhì)含量及微生物數(shù)量，改善土壤生態(tài)條件，增強土壤保水、保肥能力[3]，并且可以加快植物新陳代謝，提高植物抗逆性以應(yīng)對病蟲害等問題，促進植物健康生長[4]，同時生物有機肥可提高肥料利用率，降低農(nóng)作物生產(chǎn)成本[5]。生物有機肥的研究，解決了養(yǎng)殖場糞污處理問題[6]，有效改善了養(yǎng)殖場的環(huán)境，降低對周遭環(huán)境污染的風(fēng)險[7]，降低禽流感等疫病的傳播幾率，提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量，緩解了農(nóng)業(yè)固體有機廢棄物的排放污染與資源浪費。生物有機肥是推進資源可持續(xù)發(fā)展的迫切需要，也符合國家發(fā)展的戰(zhàn)略需要。

研究表明，作為以畜禽糞便為主要原料的生物有機肥中，雞糞生物有機肥降低土壤重金屬污染的效果最好，能顯著改善土壤中鉛的形態(tài)，降低其生物活性[8]。本研究以雞糞為生物有機肥原料，與稻殼、豆粕、鋸末[9]進行配料，加入釀酒酵母、哈茨木霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌[10]配成的復(fù)合菌劑，進行固體發(fā)酵，在對照試驗的基礎(chǔ)上展開混料設(shè)計，探究輔料及菌種的最佳配比，選擇發(fā)酵溫度、含水量以及接種量進行單因素試驗，并根據(jù)分析結(jié)果進行響應(yīng)面優(yōu)化工藝參數(shù)，以期為生物有機肥發(fā)酵工藝研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料、試劑及儀器

1.1.1 試驗原料及輔料 原料雞糞，由唐山市曹妃甸區(qū)唐海八農(nóng)場養(yǎng)雞場提供。輔料（稻殼、豆粕、鋸末），在淘寶店鋪購買。

1.1.2 試驗菌種及試劑 復(fù)合菌劑（釀酒酵母、哈茨木霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌），北海強興生物科技有限公司。草酸，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；濃硫酸，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；均為優(yōu)級純。肥料試劑全套，鄭州歐柯奇儀器制造有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備OK-V24型土壤肥料養(yǎng)分速測儀，鄭州歐柯奇儀器制造有限公司；ZXSD-B1160型液晶顯示屏生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；motic BA200型生物顯微鏡，北京翔天智遠科技；STARTER 3C型酸度計，奧豪斯儀器（上海）有限公司制造；DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZQ-C型空氣浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 單因素試驗設(shè)計 根據(jù)原料雞糞中是否加入輔料和微生物菌劑，設(shè)置3個處理組，各組處理見表1。每個處理重復(fù)3次，其他變量均一致，每天監(jiān)測溫度、含水量、活菌數(shù)、有機質(zhì)。

表1 試驗分組及處理

1.2.2 輔料配比試驗設(shè)計 根據(jù)原料雞糞中加入輔料（稻殼、豆粕、鋸末）的比例不同，利用混料設(shè)計設(shè)置16個處理組，各組處理見表2。

表2 輔料配比混料設(shè)計

1.2.3 菌種配比試驗設(shè)計 根據(jù)原料雞糞中加入復(fù)合菌劑的菌種比例不同，利用混料設(shè)計設(shè)置25個處 理組，各組處理見表3。

表3 菌種配比混料設(shè)計

1.2.4 工藝優(yōu)化試驗設(shè)計（1）根據(jù)復(fù)合菌劑的總接種量不同，設(shè)置5個處理組，各組處理見表4。每個處理重復(fù)3次，其他無關(guān)變量均一致。待好氧發(fā)酵5 d腐熟完成后，檢測活菌數(shù)及有機質(zhì)。

表4 不同接種量試驗分組及處理

（2）根據(jù)含水量不同，設(shè)置5個處理組，各組處理見表5。每個處理重復(fù)3次，其他無關(guān)變量均一致。待好氧發(fā)酵5 d腐熟完成后，檢測活菌數(shù)及有機質(zhì)。

表5 不同含水量試驗分組及處理

（3）根據(jù)發(fā)酵的溫度不同，設(shè)置5個處理組，各組處理見表6。每個處理重復(fù)3次，其他無關(guān)變量均一致。待好氧發(fā)酵5 d腐熟完成后，檢測活菌數(shù)及有機質(zhì)。

表6 不同發(fā)酵溫度試驗分組及處理

1.3 指標測定與方法

1.3.1 溫度 大堆體使用堆肥專業(yè)溫度計，將探頭深入到堆體內(nèi)20 cm處，當(dāng)溫度計示數(shù)開始下降時，取最高溫度為堆體溫度。小堆體使用量程為100℃的紅水溫度計測溫，將溫度計深入到距瓶底1cm處，觀察溫度計示數(shù)，當(dāng)溫度計示數(shù)開始下降時，取最高溫度為堆體溫度。

1.3.2 含水量 用105℃烘干30 min后冷卻至室溫的鋁盒裝樣20 g，105℃烘干5 h，取出在干燥器中冷卻至室溫后稱量，鋁盒的初始質(zhì)量m0（單位為g），裝樣后的質(zhì)量m1（單位為g），烘干后的質(zhì)量m2（單位為g）。計算堆肥樣品的含水量ω（單位為%），計算公式為：

1.3.3 活菌數(shù) 稱取10 g樣品于錐形瓶中，加入100 mL無菌水，封口膜封口，靜置20 min后放入振蕩器，室溫200 r·min-1振蕩30 min后取出梯度稀釋，使用血球計數(shù)板進行活菌計數(shù)。

1.3.4 有機質(zhì) 按土壤肥料養(yǎng)分速測儀說明書要求稱取濃度對應(yīng)質(zhì)量樣品置于錐形瓶中，加入指定試劑，沸水浴30 min，冷卻至室溫后，定容，上機測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Design-Expert 12軟件對實驗方案進行設(shè)計，并對數(shù)據(jù)進行整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

如圖1所示，在5 d發(fā)酵周期內(nèi)，空白組的溫度低于試驗組1的發(fā)酵溫度，試驗組1溫度呈先下降后平穩(wěn)趨勢；而空白組呈持續(xù)下降趨勢。呈圖2所示，在5 d的發(fā)酵周期中，試驗組1含水量下降趨勢緩慢，始終維持在45%以上，而空白組呈現(xiàn)急劇下降狀態(tài)。

圖1 溫度隨發(fā)酵天數(shù)的變化曲線

圖2 含水量隨發(fā)酵天數(shù)的變化曲線

如圖3所示，在5d的發(fā)酵周期內(nèi)，試驗組1的活菌數(shù)始終高于空白組，在第2天差值達到最大，為227.5×108CFU·g-1。圖4顯示，雞糞中的有機質(zhì)在試驗組1的處理下，始終高于空白組，在第5天有機質(zhì)含量達45%。

圖3 活菌數(shù)隨發(fā)酵天數(shù)的變化曲線

圖4 有機質(zhì)隨發(fā)酵天數(shù)的變化曲線

由圖5可知,試驗組2維持活菌數(shù)優(yōu)于試驗組1，第5天仍有425×108CFU·g-1活菌。圖6顯示，試驗組1由于未添加微生物菌劑，有機質(zhì)的消耗較少，試驗組2的有機質(zhì)含量在第5天仍達到47.68%。

圖5 活菌數(shù)隨發(fā)酵天數(shù)的變化曲線

圖6 有機質(zhì)隨發(fā)酵天數(shù)的變化曲線

綜合分析可知，加入輔料后，生物有機肥發(fā)酵溫度、含水量、活菌數(shù)及有機質(zhì)均較對照組有顯著提高，在添加輔料的基礎(chǔ)上加入復(fù)合菌劑，活菌數(shù)會再次提高。

2.2 輔料配比試驗結(jié)果

不同的輔料配比對生物有機肥發(fā)酵的影響不同，適宜的輔料配比有利于生物有機肥營養(yǎng)更加豐富，同時節(jié)約生產(chǎn)成本。利用混料設(shè)計探究輔料配比的試驗結(jié)果見表7。

表7 輔料配比混料設(shè)計結(jié)果

由表7所示，當(dāng)雞糞中活菌數(shù)最高達554×108CFU·g-1時，稻殼、豆粕、鋸末比例為10%∶20%∶10%，但有機質(zhì)含量不佳；而當(dāng)有機質(zhì)含量最高為55.67%時，稻殼、豆粕、鋸末比例為12.35%∶15.62%∶12.02%，活菌數(shù)不太理想。

利用Design-Expert 12軟件進行混料設(shè)計分析，可知稻殼、豆粕、鋸末比例為14.167%∶10.833%∶15.000%時，發(fā)酵效果最好，活菌數(shù)為611.660×108CFU·g-1，有機質(zhì)含量為45.447%。

根據(jù)實際情況，取稻殼、豆粕、鋸末比例為14.17%∶10.83%∶15.00%進行后續(xù)試驗。

2.3 菌種配比試驗結(jié)果

菌種之間存在協(xié)同、拮抗等效應(yīng)，當(dāng)其他條件一定時，不同的菌種配比會產(chǎn)生不同的發(fā)酵效果，合理的菌種比例有利于提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。利用混料設(shè)計探究菌種配比的試驗結(jié)果見表8。

表8 菌種配比混料設(shè)計結(jié)果

由表8可知，當(dāng)哈茨木霉和地衣芽孢桿菌比例為48.31%∶51.69%，不添加其他菌種時，雞糞中活菌數(shù)達到最大為592×108CFU·g-1；當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌和枯草芽孢桿菌比例為51.14%∶48.86%，不添加其他菌種時，雞糞中有機質(zhì)含量達到最高為86.9%。

利用Design-Expert 12軟件進行菌種混料設(shè)計分析，可知釀酒酵母、哈茨木霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌的比例為15.013%∶4.199%∶58.041%∶2.202%∶20.545%時，發(fā)酵效果最好，活菌數(shù)為495.720×108CFU·g-1，有機質(zhì)含量為48.833%。

根據(jù)實際情況，取釀酒酵母、哈茨木霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌的比例為15.01%∶4.20%∶58.04%∶2.20%∶20.55%進行后續(xù)試驗。

2.4 工藝優(yōu)化試驗結(jié)果

2.4.1 接種量對雞糞生物有機肥發(fā)酵的影響 接種量是指接入菌液體積與基質(zhì)質(zhì)量的比率，是影響發(fā)酵品質(zhì)的一個主要因素。過量接種，基質(zhì)中養(yǎng)分缺乏會使細菌的生長受到抑制；接種數(shù)量太少，會導(dǎo)致基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)浪費，從而影響發(fā)酵的生產(chǎn)能力。如圖7所示，隨總接種量的增加，雞糞的有機質(zhì)含量先減少后增加，接種量為0.04%時有機質(zhì)含量達最高點為65%；活菌數(shù)呈先增加后趨于平穩(wěn)的狀態(tài)，接種量0.05%時數(shù)量活菌數(shù)最多，為462.5×108CFU·g-1。

由圖7可知，菌種總占比為0.04%時，有機質(zhì)最優(yōu)，活菌數(shù)在最優(yōu)范圍內(nèi)，因此，選擇接種量為0.04%時，發(fā)酵效果最好。

圖7 接種量對雞糞生物有機肥發(fā)酵的影響

2.4.2 含水量對雞糞生物有機肥發(fā)酵的影響 含水量指飼料發(fā)酵前加入飼料中水分的體積與固體原料質(zhì)量之比。含水量多少影響發(fā)酵培養(yǎng)基的疏松度，進而影響原料的溶氧、傳氧、營養(yǎng)成分的擴散和菌種對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。由圖8所示，隨含水量的增加，雞糞中的有機質(zhì)呈急劇上升后趨于平穩(wěn)然后再下降的狀態(tài)，含水量為60%時有機質(zhì)最高，達68%；活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢，含水量55.0%時活菌數(shù)最少，為145×108CFU·g-1。

經(jīng)圖8分析，水分占比為60%時，可得到較為適宜的有機質(zhì)含量，且活菌數(shù)較高，因此，當(dāng)含水量為60%時，發(fā)酵效果最好。

圖8 含水量對雞糞生物有機肥發(fā)酵的影響

2.4.3 發(fā)酵溫度對雞糞生物有機肥發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度指發(fā)酵過程中培養(yǎng)基所處環(huán)境溫度，不同的發(fā)酵溫度會產(chǎn)生不同的發(fā)酵效果。在高溫條件下發(fā)酵，細菌降解對其它細菌的生長有一定影響；在低溫條件下發(fā)酵，微生物不能完全吸收養(yǎng)分，限制其生長。圖9顯示，隨發(fā)酵溫度的增加，雞糞中的有機質(zhì)和活菌數(shù)均呈現(xiàn)先上升再下降最后趨于平穩(wěn)的狀態(tài)，有機質(zhì)含量在發(fā)酵溫度為65℃時達最高為48.75%，而活菌數(shù)在發(fā)酵溫度為57.5℃時達到最大為350×108CFU·g-1。

圖9 發(fā)酵溫度對雞糞生物有機肥發(fā)酵的影響

經(jīng)上述分析可知，溫度為57.5℃時，活菌數(shù)可取最高值，有機質(zhì)含量較為適宜，因此，當(dāng)發(fā)酵溫度為57.5℃時，發(fā)酵效果最好。

3 結(jié)論與討論

中國微生物肥料歷史悠久，進入21世紀后，基因工程菌肥、生物有機肥等新型肥料出現(xiàn)并迅速發(fā)展。大量研究表明，生物有機肥可改善土壤的物理及化學(xué)性質(zhì)[11]，提高作物產(chǎn)量[12]。Miftakhurrohmat等[13]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌和木霉屬混合可顯著影響植物的高度、莖直徑、葉數(shù)和葉面積。劉麗[14]研究確定，生物有機肥品質(zhì)的高低決定于其所含的功能菌數(shù)量及活性。黃文粵[15]等研究確定，有機肥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中減少或防止土壤重金屬污染的重要手段。周可等[16]研究發(fā)現(xiàn)，雞糞接種微生物菌劑可顯著提高雞糞中微生物數(shù)量，促進堆肥快速腐熟。

本研究選取釀酒酵母、哈茨木霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌配成復(fù)合菌劑，以雞糞為生物有機肥原料，添加輔料稻殼、豆粕、鋸末進行固體發(fā)酵，摸索雞糞生物有機肥的發(fā)酵工藝。與前人研究結(jié)果相比，本研究在添加微生物菌劑進行發(fā)酵的基礎(chǔ)上，確定了詳細的發(fā)酵工藝參數(shù)，獲得最優(yōu)的活菌數(shù)量和有機質(zhì)含量，達到最好的發(fā)酵效果。

本研究結(jié)果表明，雞糞生物有機肥發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為輔料稻殼、豆粕、鋸末配比為14.17%∶10.83%∶15.00%，復(fù)合菌劑釀酒酵母、哈茨木霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌配比為15.01%∶4.20%∶58.04%∶2.20%∶20.55%，接種量為0.04%，含水量為60%，溫度為57.5℃。在此條件下發(fā)酵，生物有機肥的有效活菌數(shù)（≥0.2×108CFU·g-1）、有機質(zhì)含量等可達到NY884—2012《國家生物有機肥標準》。