崔聯(lián)明，王 琳，高麗敏，郭東森，周 影，魏啟舜

（1.江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 南京 210046；2.江蘇開放大學(xué) 鄉(xiāng)村振興學(xué)院，江蘇 南京 210000）

隨著畜禽業(yè)的發(fā)展，全球每年產(chǎn)生羽毛廢棄物超過1000萬t[1]，我國每年羽毛廢棄物產(chǎn)生量也在百萬t以上。羽毛中角蛋白含量超過85%，是一種潛在的氨基酸和蛋白來源。角蛋白是一類難溶于水且富含多種氨基酸的纖維狀結(jié)構(gòu)蛋白，分子鏈內(nèi)和分子鏈之間存在二硫鍵、氫鍵、鹽鍵等結(jié)構(gòu)，使其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難以被降解利用，因此大量羽毛被填埋及焚燒，造成了嚴(yán)重的資源浪費、環(huán)境污染，甚至引起疾病[2]。因此，充分利用羽毛廢棄物不僅可以減輕環(huán)境污染，還能促進(jìn)資源的循環(huán)利用。

羽毛經(jīng)降解可產(chǎn)生氨基酸，氨基酸是參與合成蛋白質(zhì)的基本分子，是保障動植物進(jìn)行正常生理活動的重要組分。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，氨基酸作為植物必須的營養(yǎng)元素，具有分子量小、容易被動植物吸收利用的特點，能夠有效促進(jìn)作物生長、提高作物產(chǎn)量并改善品質(zhì)[3-4]。袁祖華等[5]通過在辣椒葉面噴施氨基酸肥，辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)均得到了提高。人類需要從外界獲取8種必需氨基酸，分別是：亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸。谷氨酸鈉是最早被人類應(yīng)用的氨基酸，作為味精的主要成分被廣泛應(yīng)用于調(diào)味劑中。在醫(yī)藥行業(yè)中，氨基酸對許多消化道疾病、心血管病、呼吸道病等有良好的療效，且許多藥物已投入生產(chǎn)。徐莉英等[6]合成出了β-欖香烯氨基酸的衍生物，其被證明具有抗腫瘤活性。此外，氨基酸在水產(chǎn)、畜牧業(yè)中也常常作為添加劑，在保健品中也有廣泛的應(yīng)用。

目前，羽毛的降解主要依靠物理法（高溫蒸煮法和膨化法）和化學(xué)法（酸堿水解法）[7]，但存在著能耗高、工藝復(fù)雜、污染環(huán)境、破壞氨基酸結(jié)構(gòu)、造成產(chǎn)品營養(yǎng)損失等問題[8]。微生物法和酶解法作為2種新興的羽毛降解技術(shù)，具有過程溫和、對氨基酸破壞較小，降解效果顯著等優(yōu)點。但酶解法存在成本高、單一酶降解效果不好等問題，而利用微生物直接降解羽毛步驟簡單，成本低廉，但需要對樣品的前處理和發(fā)酵工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化以提高氨基酸轉(zhuǎn)化率。

先前研究篩選到一株高效羽毛降解菌地衣芽孢桿菌ZSZ6[9]，其在好氧發(fā)酵條件下，氨基酸轉(zhuǎn)化率約為19%。本研究通過優(yōu)化地衣芽孢桿菌ZSZ6的發(fā)酵工藝，研究了靜置處理前的好氧培養(yǎng)時間、靜置溫度、還原劑預(yù)處理、添加金屬離子等對羽毛降解產(chǎn)氨基酸效果的影響，綜合比較了各種處理對羽毛降解氨基酸產(chǎn)量的影響，以期尋求最佳的靜置處理工藝。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 地衣芽孢桿菌ZSZ6由江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所微生物實驗室篩選、保存。

1.1.2 羽毛粉 羽毛粉購自安徽文翔羽絨制品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，pH值7.2～7.4；121℃下高壓滅菌20 min。羽毛粉培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g·L-1、磷酸氫二鉀1 g·L-1、氯化鈉1 g·L-1、羽毛粉10%，pH值7.2～7.4；在121℃下高壓滅菌20 min。所有試劑均選用商業(yè)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 游離氨基酸含量的測定 采用茚三酮法GB/TB 314—2013。

1.2.2 好氧發(fā)酵后靜置對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響 向裝液量為100 mL的羽毛粉培養(yǎng)基中加入5%（v/v）地衣芽孢桿菌ZSZ6，對照組CK發(fā)酵條件為37℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)；試驗處理組為37℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d后于37℃靜置反應(yīng)。測定2種處理組2～7 d的氨基酸含量。

1.2.3 好氧發(fā)酵時間對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響 向裝液量為100 mL的羽毛粉培養(yǎng)基中加入5%（v/v）地衣芽孢桿菌ZSZ6，對照組CK發(fā)酵條件為37℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)；試驗處理組為37℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)0.5、1、2 d后，于37℃靜置反應(yīng)。測定幾種處理組2～7 d的氨基酸含量。

1.2.4 靜置溫度對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響 向裝液量為100 mL的羽毛粉培養(yǎng)基中加入5%（v/v）地衣芽孢桿菌ZSZ6，對照組CK發(fā)酵條件為37℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)；試驗處理組為37℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d后，分別于37、45、55℃條件下靜置反應(yīng)。于第6天測定幾種處理組氨基酸含量。

1.2.5 還原劑預(yù)處理羽毛粉對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響 向裝液量為100 mL的羽毛粉培養(yǎng)基中加入5%（v/v）地衣芽孢桿菌ZSZ6，并分別添加1%（w/v）的二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇、Na2SO3，并將地衣芽孢桿菌ZSZ6按照5%（v/v）的接種量接種到羽毛粉培養(yǎng)基中，對照組CK發(fā)酵條件為37℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)；試驗處理組為37℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d后，于55℃條件下靜置反應(yīng)。第6天測定幾種處理組氨基酸含量。

1.2.6 添加金屬離子對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響 向裝液量為100 mL的羽毛粉培養(yǎng)基中加入5%（v/v）地衣芽孢桿菌ZSZ6，對照組CK發(fā)酵條件為37℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)；試驗處理組為37℃、180 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)2 d后，分別添加0.1%（w/v）的FeSO4、FeCl3、CuSO4、MnSO4、MgSO4后靜置反應(yīng)，并檢驗添加最優(yōu)金屬離子的其他鹽類后菌株降解羽毛粉的氨基酸產(chǎn)量。第6天測定幾種處理組氨基酸含量。

1.2.7 50 L發(fā)酵罐條件下靜置處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響 （1）提前泡發(fā)2組3 kg的羽毛粉，第1組不添加Na2SO3，第2組添加1%的Na2SO3，靜置過夜。

（2）將地衣芽孢桿菌ZSZ6一級種子液按照2%的比例接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r·min-1培養(yǎng)16 h得到二級種子液。

（3）發(fā)酵罐進(jìn)行過濾器滅菌和空消后，將含有羽毛粉的羽毛培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐內(nèi)并加水至22 L進(jìn)行實消。待冷卻至室溫后，按照5%的比例加入二級種子液進(jìn)行發(fā)酵。

第1組發(fā)酵條件：控制pH值為7，攪拌轉(zhuǎn)速180 r·min-1，發(fā)酵溫度37℃，溶氧DO在20%～40%，共6 d。

第2組調(diào)整發(fā)酵條件：第一階段為菌體生長階段（48 h內(nèi)），初始pH值為7，攪拌轉(zhuǎn)速180 r·min-1，發(fā)酵溫度37℃，溶氧DO控制在20%～50%；第二階段為羽毛粉降解產(chǎn)氨基酸階段（48 h后），調(diào)整pH值至8，溫度至55℃，加入0.1%MnSO4，并停止攪拌和通氣，每隔12 h進(jìn)行1次持續(xù)15 min的攪拌，繼續(xù)發(fā)酵4 d。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個處理組重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用SPSS 19和GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析和繪圖，所有數(shù)據(jù)采用LSD方法進(jìn)行多重比較，不同字母表示LSD檢驗5%水平差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 好氧發(fā)酵后靜置對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的影響

先前研究探究了地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛產(chǎn)游離氨基酸的最適發(fā)酵條件，本試驗在其基礎(chǔ)上探究了靜置處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)游離氨基酸的影響。結(jié)果顯示（圖1），在整個發(fā)酵過程中，傳統(tǒng)的好氧發(fā)酵和好氧發(fā)酵2 d后進(jìn)行靜置處理的2種發(fā)酵過程中游離氨基酸的含量均持續(xù)上升，但是靜置處理條件下氨基酸濃度上升速度明顯高于傳統(tǒng)好氧發(fā)酵。發(fā)酵第7天，持續(xù)好氧發(fā)酵游離氨基酸產(chǎn)量約為19.25 g·L-1，好氧發(fā)酵2 d后靜置處理游離氨基酸產(chǎn)量約為28.85 g·L-1。

圖1 傳統(tǒng)好氧發(fā)酵(CK)和靜置處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響

2.2 好氧發(fā)酵時間對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的影響

為探究地衣芽孢桿菌ZSZ6最佳生長、產(chǎn)酶時間，分別將細(xì)菌培養(yǎng)0.5、1、2 d后進(jìn)行靜置，以確定最適好氧培養(yǎng)時間。結(jié)果顯示（圖2），在發(fā)酵第2天，好氧發(fā)酵2 d的氨基酸濃度高于好氧發(fā)酵0.5、1 d，且在整個發(fā)酵過程中好氧發(fā)酵2 d的氨基酸濃度均高于好氧培養(yǎng)0.5、1 d。發(fā)酵第7天，好氧發(fā)酵0.5、1、2 d的最終氨基酸濃度分別為14.39、20.35、22.10 g·L-1。

圖2 好氧發(fā)酵時間對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響

2.3 靜置溫度對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的影響

不同酶類的最適溫度不同，為進(jìn)一步探究地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉的最佳靜置溫度，筆者研究了3種不同靜置溫度對發(fā)酵液中氨基酸含量的影響。結(jié)果顯示（圖3），在發(fā)酵第6天，于55℃靜置條件下氨基酸濃度明顯高于37℃和45℃靜置。這表明在好氧發(fā)酵2 d的條件下，55℃是最適降解溫度，推測原因可能是地衣芽孢桿菌ZSZ6所產(chǎn)的角蛋白酶在該條件下能保持較高的酶活。

圖3 靜置溫度對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響

2.4 還原劑預(yù)處理羽毛粉對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的影響

適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能夠使角蛋白更易降解，因此，筆者研究了3種還原劑1%（w/v）的DTT、巰基乙醇、Na2SO3對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的影響。結(jié)果顯示（圖4），使用1%的Na2SO3預(yù)處理羽毛粉夠明顯提升氨基酸的濃度，達(dá)到29.22 g·L-1，比對照提高約11%。使用1%DTT和巰基乙醇進(jìn)行預(yù)處理則會降低氨基酸濃度。

圖4 還原劑預(yù)處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響

2.5 添加金屬離子對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的影響

金屬離子可能對酶活性存在一定影響，不同的金屬離子會對酶產(chǎn)生促進(jìn)或者抑制作用。本試驗研究了在好氧培養(yǎng)階段后、在靜置之前，添加不同金屬離子對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的影響。結(jié)果顯示（圖5），F(xiàn)eSO4、FeCl3、CuSO4、MnSO4、MgSO4對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸均有一定提高，其中MnSO4提升量最大，在第6天達(dá)到約35.41 g·L-1，比對照（26.23 g·L-1）提高了約35%。此外，本研究驗證了MnSO4、MnCl2、Mn(NO3)2對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的影響（圖6）。結(jié)果顯示，不同錳鹽之間并沒有表現(xiàn)出差異。這表明錳鹽對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸產(chǎn)生的影響主要是依賴于錳離子。

圖5 金屬離子對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響

圖6 不同錳鹽對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響

2.6 50 L發(fā)酵罐條件下靜置處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的影響

為進(jìn)一步檢驗靜置處理在擴(kuò)大化處理的情況下是否能提高氨基酸的產(chǎn)量，筆者研究了在50 L發(fā)酵罐水平下靜置處理對羽毛粉降解產(chǎn)氨基酸的影響。結(jié)果如圖7所示，2個處理組在2～5 d的時間內(nèi)氨基酸濃度均有所提高，但靜置處理組的提高速度遠(yuǎn)大于對照組。在測量的6 d內(nèi)，CK組生產(chǎn)氨基酸在第6天達(dá)到峰值，約為17.51 g·L-1；靜置組在第5天可以達(dá)到峰值，約為39.50 g·L-1。由此可見，即使在擴(kuò)大化處理的復(fù)雜情況下，靜置處理仍然能夠大幅提高氨基酸產(chǎn)量。

圖7 50 L發(fā)酵罐水平下靜置處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸效果的影響

3 結(jié)論與討論

角蛋白的空間結(jié)構(gòu)存在著很多的氫鍵、二硫鍵、疏水鍵等強(qiáng)相互作用，形成了復(fù)雜的三維超螺旋結(jié)構(gòu)，使角蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜而緊密，難以被降解，部分還原劑有助于促使角蛋白中二硫鍵的斷裂，加速角蛋白的降解[10]。角蛋白酶是一種可降解水不溶性角蛋白的酶，其來源于一些具有角蛋白降解活性的細(xì)菌、真菌、放線菌。目前已報道的可以降解羽毛角蛋白的微生物種類繁多，研究表明地衣芽孢桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌、梭狀芽孢桿菌[11]、枯草芽孢桿菌[12]等降解羽毛的效果顯著，且與角蛋白酶的活性密切相關(guān)。張昕[13]通過對枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，在72 h羽毛降解率為69.61%；發(fā)酵液的氨基酸含量達(dá)22.66 mg·mL-1；周蓮等[14]通過對解淀粉芽孢桿菌3-2發(fā)酵羽毛的發(fā)酵工藝優(yōu)化，在108 h氨基酸總含量達(dá)到20.861 g·kg-1。本研究對地衣芽孢桿菌ZSZ6進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，搖瓶條件下在第6天氨基酸含量可達(dá)35.41 g·L-1，高于其他菌株發(fā)酵效果，實現(xiàn)了氨基酸產(chǎn)量的大幅提升。

羽毛降解產(chǎn)氨基酸主要依賴于角蛋白酶，而角蛋白酶的活性受到多種因素影響。一般認(rèn)為，微生物在降解羽毛時會產(chǎn)生多種酶類聯(lián)合降解角蛋白。Williams[15]研究了一株從厭氧條件下分理處的地衣芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其好氧生長快于厭氧生長，而在厭氧條件下降解角蛋白積累氨基酸的能力優(yōu)于好氧條件。這一結(jié)果和筆者得到的結(jié)果相一致（圖1），推測原因可能是在好氧發(fā)酵過程中，地衣芽孢桿菌ZSZ6可能會利用部分氨基酸替代羽毛粉進(jìn)行生理活動，導(dǎo)致體系中氨基酸含量的減少；而靜置處理造成了厭氧的環(huán)境條件，使好氧菌正常生長代謝降低，減少了對氨基酸的消耗。因此，在細(xì)菌生長繁殖、產(chǎn)酶達(dá)到一定程度后，進(jìn)行靜置處理能夠有效提高體系中氨基酸的含量。不同微生物分泌的角蛋白酶的最適溫度存在一定差異，常見的角蛋白酶最適溫度在35～60℃之間。地衣芽孢桿菌ZSZ6在37℃，180 r·min-1培養(yǎng)2 d時，體系中細(xì)菌數(shù)量和酶活均達(dá)到了最適宜降解羽毛粉的條件（圖1、圖2），并在55℃靜置時氨基酸產(chǎn)量最高（圖3）。大部分金屬離子都會對角蛋白酶活存在一定影響，如Mg2+、Ca2+、Mn2+對很多角蛋白酶有促進(jìn)作用，而Zn2+、Cu2+、Hg2+等對部分角蛋白酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用[16-17]。本研究中Mn2+極大的提高了氨基酸的產(chǎn)量，且Cu2+和Fe3+也有一定的提升作用（圖5、圖6）。還有研究表明，一些還原劑如DTT、巰基乙醇、亞硫酸鈉等可以提高角蛋白酶的活性[18]，而本研究中DTT、巰基乙醇對氨基酸的產(chǎn)量有明顯的抑制作用（圖4），推測原因可能是3種還原劑可以加速羽毛中二硫鍵斷裂，但是DTT和巰基乙醇會對地衣芽孢桿菌ZSZ6生長產(chǎn)生抑制作用，而Na2SO3則不會影響對細(xì)菌產(chǎn)生負(fù)面影響。

本研究初步探究了靜置處理下地衣芽孢桿菌ZSZ6對降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的影響，并進(jìn)一步優(yōu)化了降解條件，提高了游離氨基酸產(chǎn)量。通過單因素試驗考察外加靜置處理前的好氧培養(yǎng)時間、靜置溫度、還原劑預(yù)處理、添加金屬離子等對羽毛降解產(chǎn)氨基酸效果的影響。結(jié)果表明，經(jīng)1%Na2SO3預(yù)處理的羽毛粉，在37℃、180 r·min-1好氧發(fā)酵2 d后，添加0.1%MnSO4并置于55℃條件下靜置處理，在優(yōu)化條件下發(fā)酵6 d，產(chǎn)物中的游離氨基酸含量可達(dá)35.41 g·L-1（比對照組提高約84%），轉(zhuǎn)化率約35%（比對照組提高約16%），極大地提高了氨基酸產(chǎn)量，這表明靜置處理是一種能夠有效提高地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產(chǎn)氨基酸的方法，后續(xù)研究需要進(jìn)一步優(yōu)化其在羽毛降解上的應(yīng)用。