馬宏偉，王 琢，王向濤

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,藥用植物研究所，北京 100193)

高血壓是目前全球首要致死、致殘疾病(心血管疾病，CVD)的主要可控危險因素之一[1～2]。長期高血壓會導(dǎo)致心、腦、腎等重要器官的病理損害及一系列相關(guān)并發(fā)癥，而對高血壓的治療目前主要借助西藥，但這些藥物通常具有較大的毒副作用[3-4]，因此開發(fā)相關(guān)功能性膳食產(chǎn)品很有意義及前景。

雞蛋作為人們?nèi)粘＋@取能量的主要物質(zhì)之一，與人們的生活息息相關(guān)。隨著科技的發(fā)展，雞蛋的作用無限延伸，在化工、美容、醫(yī)藥等行業(yè)都扮演著重要角色[5-6]。根據(jù)相關(guān)文獻報道，雞蛋蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的多肽，特別是分子量小于3 000 D的短肽[7-8]有顯著的功能性，如抗氧化、降血脂、降血壓等。醋蛋是我國傳統(tǒng)經(jīng)典偏方，通過酸水解產(chǎn)生多肽，從而發(fā)揮降壓作用[9-12]。然而，醋蛋在風(fēng)味等方面存在明顯缺陷，患者服用接受度極低，因此將其優(yōu)化成一種患者可接受的功能性蛋白多肽產(chǎn)品很有必要。目前市場上功能性蛋制品產(chǎn)品混雜，大多存在功能性不明確、產(chǎn)品風(fēng)味及溶解性差等問題，用胰酶直接酶解雞蛋得到的產(chǎn)品存在腥味過重、功能性較弱等問題[13-14]，因此后期參考相關(guān)文獻，應(yīng)對蛋黃蛋清分別進行處理。當(dāng)前，雞蛋蛋黃作為工業(yè)上獲取磷脂的重要原料之一[15-16]，脫脂殘留后的蛋白質(zhì)被大大浪費，據(jù)報道，脫脂蛋黃進一步酶解，顯著提高了其降壓作用[17-18]。雞蛋蛋清中脂類含量雖少，但由于蛋清占整枚雞蛋70%以上，因此所含蛋白總量相當(dāng)可觀。蛋清富含多種蛋白質(zhì)，其中卵清蛋白對蛋白酶活性有很強的抑制作用，且有很高的熱穩(wěn)定性[19-20]。筆者對蛋黃和蛋清分別進行脫脂及滅活處理，之后進一步酶解，且通過體內(nèi)動物試驗驗證產(chǎn)品功能性作用及粉體學(xué)相關(guān)表征，考察蛋清和蛋黃分別經(jīng)一定處理后，對所得產(chǎn)品功效及性狀是否有積極作用，期望得到性狀良好的功能性膳食產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑水浴鍋[步琦實驗室設(shè)備貿(mào)易(上海)有限公司]，moorLAB-NIBP無創(chuàng)血壓測試儀(England by Moor intruments Ltd)，藥物透皮擴散實驗儀(RYJ-12B)，加熱破壁營養(yǎng)料理機[卡爾貿(mào)易(上海)有限公司，BV-2908A]，高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，HC-3618R)，胰酶(北京索萊寶科技有限公司)，戊巴比妥鈉(北京邁瑞達科技有限公司)，青霉素鈉(北京邁瑞達科技有限公司，1 603 U/mg)，鮮雞蛋(北京市售)。

1.2 實驗動物SD大鼠(SPF級別)50只，雄性，體重(200±20) g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和藥用植物研究所動物實驗中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證號：SLXD-20201008015。

1.3 樣品制備

1.3.1全蛋酶解凍干粉(E-H)制備。稱取雞蛋，打破后加20%去離子水(水∶雞蛋，V/W)稀釋，攪拌均勻，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.5，加1%胰酶(胰酶∶底物，W/W)在37 ℃水浴，200 r/min的轉(zhuǎn)速下酶解6 h，最后100 ℃滅活5 min，凍干成粉，得到E-H。

1.3.2未脫脂蛋黃與滅活蛋清混合酶解凍干粉(EY-IEW-H)制備。稱取雞蛋，蛋清蛋黃分離，置冰箱4 ℃?zhèn)溆?。參照Margues等[11]的蛋清滅活法，將上述分離的蛋清置于95 ℃水浴鍋中滅活5 min，流水冷卻至常溫，得滅活蛋清。最后將二者混合，加入純水(1 mL/3 g ，V/m)稀釋，攪拌均勻，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.5，加1%胰酶(底物)，在37 ℃水浴200 r/min 的轉(zhuǎn)速下酶解6 h后，100 ℃滅活5 min，凍干成粉，得EY-IEW-H。

1.3.3脫脂蛋黃與滅活蛋清混合酶解凍干粉(DEY-IEW-H)制備。參考等Bao[16]蛋黃脫脂方法，稱取雞蛋，分離蛋清、蛋黃，將蛋黃放置離心管中，加入95%乙醇(1 mL/3 g ，V/m)，超聲5 min，5 000 r/min離心10 min，除去上清，重復(fù)上述步驟2次，得脫脂蛋黃，置冰箱4 ℃?zhèn)溆?。按照?.3.2”中蛋清滅活的方法，制得滅活蛋清。且將二者混合，參照“1.3.2”中方法，對其進行酶解，得DEY-IEW-H。

1.4 產(chǎn)品綜合評價為了能制備出符合粉體學(xué)工業(yè)生產(chǎn)、風(fēng)味美味、在水中分散性好，且功效顯著的產(chǎn)品，通過粉體學(xué)相關(guān)系數(shù)(表1)、嗅覺及味覺反饋結(jié)果、復(fù)溶結(jié)果，對產(chǎn)品流動性、風(fēng)味及復(fù)溶等進行綜合打分，具體評價指標(biāo)見表2。

表1 卡爾指數(shù)與Hausner比評價

表2 綜合評價評分

1.5 腎性高血壓大鼠模型建立取40只健康雄性SD大鼠，適應(yīng)生長7 d后，測定基礎(chǔ)血壓，稱重。用1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔麻醉，左臥位固定，清除手術(shù)部位鼠毛，乙醇擦拭消毒，術(shù)前注射4萬U青霉素鈉，一切準(zhǔn)備就緒，開始手術(shù)。沿左側(cè)大腿根向上30 cm左右處，切開3 cm大小的手術(shù)切口，暴露左腎，用生理鹽水浸泡過的紗布包裹左腎，且將其推向一側(cè)，小心剝離腎動脈周圍組織，用1根2-0手術(shù)線穿過分離干凈的腎動脈，打一活結(jié)，將1根提前消完毒的0.25 mm 針灸銀針放置活結(jié)中，系緊活扣。用10萬U青霉素鈉沖洗左腎及傷口，將腎放回，用4-0手術(shù)線縫合傷口，術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素鈉[4萬U/(d·只)]。術(shù)后每10 d監(jiān)測1次血壓，待收縮壓(SBP)穩(wěn)定升至160 mmHg，且與對照組血壓有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，視為建模成功。另取10只大鼠進行假手術(shù)，即按上述造模方法進行手術(shù)，但對其左腎不進行結(jié)扎，其他操作均一致。

本文選取隨機可拓展STIRPAT模型(stochastic impacts by regression on population，affluence and technology)分析三大典型城市群城鎮(zhèn)居民生活用電影響因素。STIRPAT模型基本公式如下:

1.6 分組及給藥

1.6.1血壓最佳監(jiān)測時間的確定。取建模成功的24只RVH大鼠，隨機分成3組，分別為模型對照組(Model，3.5 mL/kg 蒸餾水)；E-H，650 mg/kg；DEY-IEW-H，650 mg/kg；假手術(shù)組為空白對照組(Control，3.5 mL/kg 蒸餾水)，分別監(jiān)測各組給藥前及給藥后2、4、6、8、24 h RVH大鼠尾動脈血壓值。之后所有大鼠恢復(fù)血壓7 d，待SBP升至160 mm Hg以上，且與Model組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，則繼續(xù)后續(xù)藥效的考察。

1.6.2雞蛋酶解物對RVH大鼠的藥效考察。取建模成功的32只RVH大鼠，隨機分成5組，分別為模型對照組(Model，2.0 mL/kg 蒸餾水)、全蛋直接酶解(E-H，400 mg/kg，ig)、EY-IEW-H(400 mg/kg)及DEY-IEW-H(400 mg/kg)，假手術(shù)組為空白對照組(Control，2 mL/kg 蒸餾水)。所有組給藥21 d，且每周監(jiān)測血壓、體重1次。參考“2.2.1”試驗結(jié)果，每次監(jiān)測血壓時間選在當(dāng)天給藥后5～6 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)品評價結(jié)果

2.1.1感官風(fēng)味。培訓(xùn)7位品嘗人員(4位女性3位男性)，對產(chǎn)品進行嗅覺和味覺分析，且每次品嘗前禁食1 h，每個樣品品嘗間隔時間不得少于15 min。經(jīng)品嘗人員反饋，E-H及EY-IEW-H腥味嚴重(1分)，DEY-IEW-H腥味改善(2分)。

2.1.2流動性。由表3可知，樣品 DEY-IEW-H卡爾指數(shù)及休止角較小，流動性良好(2分)， 樣品E-H與EY-IEW-H粉體學(xué)相關(guān)系數(shù)均過大(1分)。

表3 樣品卡爾指數(shù)、Hausner比及休止角

2.1.3溶解性。對上述2種樣品分別進行溶解性檢測，結(jié)果E-H與EY-IEW-H溶解性為1.00～10.00 g(3分)，DEY-IEW-H溶解性為≥10.00 g(4分)。

2.1.4外觀形態(tài)。從圖1可見，樣品E-H與EY-IEW-H存在部分絮狀或大顆粒，呈不規(guī)則狀態(tài)(1分)。樣品DEY-IEW-H顆粒大小規(guī)則，不產(chǎn)生靜電吸附，易分裝(3分)。

圖1 各酶解產(chǎn)物凍干粉外觀形態(tài)

表4 各樣品綜合評分結(jié)果

2.2 雞蛋酶解產(chǎn)物對RVH大鼠的血壓影響及其最佳監(jiān)測時間

2.2.1血壓最佳監(jiān)測時間的確定。從圖2a、圖2b、圖2c可知，RVH模型大鼠在24 h內(nèi)給藥組血壓值總體呈下降趨勢，在給藥后2 h便出現(xiàn)下降，直至6 h，血壓降至最低，之后血壓又開始回升，在24 h時，給藥組血壓值顯著回升，接近給藥前血壓基礎(chǔ)值。其中，DEY-IEW-H組血壓下降最為明顯，與Model組相比，DEY-IEW-H組給藥后4 h時，收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)血壓值具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，6 h時所有血壓值均有統(tǒng)計學(xué)差異，特別是SBP呈極顯著差異(P<0.01)，且其SBP從給藥前至給藥后6 h共降低了23.5 mmHg。而E-H只有SBP在6 h有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，從給藥前至給藥后6 h共降低了11.0 mmHg。在血壓下降至最低點時(6 h)，與E-H相比，DEY-IEW-H組SPB下降值有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。監(jiān)測期間，各組間心率(HR)沒有顯著性變化(圖2d)。

圖2 酶解物對RVH模型大鼠 24 h內(nèi)血壓的影響

2.2.2雞蛋酶解物對RVH大鼠的藥效。所有組給藥前監(jiān)測血壓基礎(chǔ)值，之后開始給藥，共給藥21 d，且每7 d在同一時間監(jiān)測血壓。從圖3a、圖3b、圖3c可以看出，試驗期間Model組大鼠各項血壓值呈緩慢上升趨勢，而給藥組血壓呈下降趨勢，特別是DEY-IEW-H組血壓下降最為明顯，且與給藥24 h 內(nèi)血壓變化趨勢一致。在試驗?zāi)┢?14～21 d)時，與Model組相比，DEY-IEW-H組各項血壓值(MAP、SBP、DBP)均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，其中MAP、SBP且有極顯著差異(P<0.01)。在試驗?zāi)┢冢珽-H、EY-IEW-H組與Model組相比，只有MAP與SBP有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，且這2組在整個試驗周期，各項血壓值下降趨勢及程度幾乎一致。E-H、EY-IEW-H組給藥后各項血壓值始終高于DEY-IEW-H組，且在14～21 d時，二者的SBP血壓值與DEY-IEW-H相對應(yīng)的值相比，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥期間，各組間RVH大鼠HR無明顯差異。

圖3 給藥21 d RVH模大型鼠血壓及心率變化情況

2.2.3給藥期間體重變化情況。整個試驗周期，隨著給藥時間的延長，各組實驗動物體重呈增長趨勢，E-H組由于體重基礎(chǔ)值偏低，所以整個周期其體重始終低于其他組，但各組間體重?zé)o差異(圖4)?？梢?，給予大鼠相關(guān)雞蛋酶解產(chǎn)物，對其體重?zé)o明顯影響。

圖4 給藥21 d RVH模型大鼠體重變化情況

3 結(jié)論

該研究通對樣品進行綜合評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E-H與EY-IEW-H在風(fēng)味及溶解性表現(xiàn)一般，而DEY-IEW-H與二者相比，各方面評價良好，但其在風(fēng)味的考察中，評分并不高，說明后續(xù)還需要就產(chǎn)品風(fēng)味方面進行改進。通過監(jiān)測給藥E-H、DEY-IEW-H后大鼠24 h內(nèi)血壓變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥后不同時間點大鼠血壓變化差異顯著，在給藥6 h血壓值最低。這可能是由于功能肽在給藥后5～6 h血藥濃度達到峰值，且?guī)缀醪皇芄に嚫淖兊挠绊?，因此，為了避免給藥后不同時間點測量對結(jié)果帶來的誤差，故選擇在給藥后5～6 h監(jiān)測實驗動物血壓。通過系統(tǒng)體內(nèi)試驗，可以看到E-H和EY-IEW-H二者降壓趨勢及程度幾乎一致，且降壓效果一般。筆者發(fā)現(xiàn)DEY-IEW-H組降壓效果顯著，且明顯優(yōu)于以上2組。綜上，通過研究E-H、EY-IEW-H兩組的降壓效果，結(jié)果表明對蛋清進行滅活處理，雞蛋酶解對降壓功效無影響。但二者與DEY-IEW-H的降壓結(jié)果相比，特別EY-IEW-H與DEY-IEW-H相比，證明導(dǎo)致DEY-IEW-H組降壓作用顯著優(yōu)于其他組的主要因素是蛋黃脫脂的處理。其中，蛋黃脫脂與否，對雞蛋酶解產(chǎn)物降壓功效的影響，與Jahandideh等[17]的研究結(jié)果一致，但方林求等[20]報道的蛋清中富含蛋白酶抑制劑的觀點，在該試驗中并未得到驗證，猜測或許是由于其抑制劑的量不足以影響其結(jié)果，或是與蛋黃結(jié)合，對蛋清酶解物發(fā)揮作用有影響，具體原因還需繼續(xù)探究。結(jié)合粉末綜合評價及體內(nèi)動物試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEY-IEW-H均為最佳，即在E-H的基礎(chǔ)上，對蛋黃蛋清分別進行脫脂滅活工作，不僅能顯著提高產(chǎn)品體內(nèi)降壓效果，還能改善產(chǎn)品粉體學(xué)特征。然而，所得產(chǎn)品從工業(yè)生產(chǎn)的角度考慮，該工藝較為復(fù)雜，其風(fēng)味雖有改善，但腥味仍過重，故后期可考慮與相關(guān)藥食同源性產(chǎn)品結(jié)合，繼續(xù)優(yōu)化工藝，并通過動物體內(nèi)試驗對藥效進行持續(xù)跟進評價，旨在得到真正能夠走向市場的功能性膳食產(chǎn)品。