劉 潔，王曉賢，林雨虹，林 偉

福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院，福建 福州 350009

地中海貧血（以下簡稱地貧）是一種遺傳性溶血性疾病，它的發(fā)病原因為珠蛋白基因缺陷，進而引起血紅蛋白合成障礙導(dǎo)致貧血，是世界上發(fā)病率最高的單基因遺傳疾病。地貧主要分布在包括我國南方在內(nèi)的世界上熱帶和亞熱帶瘧疾高發(fā)地區(qū)［1］，福建省地貧總攜帶率為4.41%，其中，α-地貧占72.4%［2］。

地貧根據(jù)其基因改變的類型不同，主要分為α-地貧和β-地貧。β-地貧主要由β基因的點突變所致。α-地貧又分為缺失型α-地貧和非缺失型α-地貧，α-地貧大多數(shù)是由于α珠蛋白基因的缺失所致，即缺失型α-地貧,常見的變異類型有-α3.7/、-α4.2/、--SEA/；α-地貧少數(shù)由基因點突變造成即非缺失型α-地貧,常見的變異類型有αWSα、αCSα、αQSα［3-5］。α-地貧表型的嚴(yán)重程度與染色體的單倍型密切相關(guān)，其中，兩個α基因都發(fā)生變異的疾病表型程度嚴(yán)重一些，輕者可無臨床癥狀，重者可致死、致殘、因而嚴(yán)重威脅人類健康。此外，部分點突變導(dǎo)致的α-地貧（如HbCS、HbQS）合并輕型α-地貧（--/α）表型加重，即（--/αCSα）和（--/αQSα）可能比（--/-α）更嚴(yán)重［6］。其中，巴氏胎兒水腫綜合征為最常見遺傳病，該疾病是HBA基因中由純合SEA缺失（--/--）引起［7］。攜帶巴氏水腫胎的孕婦通常會增加圍產(chǎn)期并發(fā)癥的風(fēng)險，如先兆子癇和產(chǎn)后出血［8］，危害孕婦及胎兒健康。

目前，對于地貧的檢測主要是依賴絨毛活檢、羊水穿刺及臍血穿刺等有創(chuàng)方法獲得胎兒基因信息，檢測時間窗較窄、具有胎兒損傷風(fēng)險、實驗室診斷周期較長、工作量大。因此，臨床上需要更早期、快速、精準(zhǔn)、無創(chuàng)、安全的檢測方法。盡管有報道［9-10］顯示，超聲方法可以發(fā)現(xiàn)巴氏水腫胎，但該指標(biāo)缺乏特異性，不能有效預(yù)測地中海貧血的發(fā)生。分子診斷方法仍是預(yù)測地中海貧血的首選方法，隨著無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（non-invasive prenatal testing，NIPT）染色體異常的技術(shù)得以應(yīng)用和成熟，孕婦血漿中胎兒DNA成分成為檢測胎兒基因組的重要工具，相較于有創(chuàng)方法取樣更簡便，更容易被接受。胎盤來源于母體血漿的游離胎兒DNA（circulation free fetal DNA，cffDNA）的存在，使得非侵入性工具的發(fā)展能夠從母體血液中檢測胎兒基因異常。目前，常見非整倍體（如唐氏綜合征）的NIPT在臨床上可用作篩查試驗，其準(zhǔn)確率大于99.9%［11-12］。最近，NIPT也可用于某些基因組微缺失（如DiGeorge綜合征、Cri-du-chat綜合征）。因此，有望基于cffDNA開展對α-地貧基因進行檢測，判斷胎兒的α-地貧基因型。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2018年10月—2021年4月福州市第一醫(yī)院就診及轉(zhuǎn)診的22個α-地貧基因攜帶家系的孕婦作為研究對象，所有家系均攜帶α-地貧基因突變，除去家系2、21和22外（表1），所有家系的胎兒均有患巴氏胎兒水腫綜合征的風(fēng)險。本研究不影響孕婦自身的臨床檢查流程。

表1 22例家系中無創(chuàng)產(chǎn)前檢測與有創(chuàng)診斷結(jié)果情況

1.2 方法

1.2.1 孕婦及其配偶血液采集和處理 用EDTA抗凝采血管從孕婦和其丈夫前臂收集2 mL外周血，參照地貧基因檢測試劑盒（PCR-反向點雜交法）（亞能生物）說明書，檢測孕婦及其丈夫的地貧基因型。此外，在孕婦抽取羊水前，用EDTA抗凝采血管從孕婦前臂收集5mL外周血。采血后3 h內(nèi)在4℃下進行兩次1 600 g離心10min的方法分離血漿，然后取其中1.2 mL血漿，使用MagPure circulating DNA kit提取游離DNA，然后在-80℃下保存。

1.2.2 羊水標(biāo)本采集和處理 入組孕婦在妊娠16～22周時，行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取20 mL羊水。參照地中海貧血基因檢測試劑盒（PCR-反向點雜交法）（亞能生物）說明書，檢測胎兒地貧基因型。1.2.3 胎兒無創(chuàng)性地貧基因檢測 從冰箱取出游離DNA，根據(jù)Ion Plus Fragment library kit（Thermo-Fisher Scientific）說明書進行文庫構(gòu)建，在文庫構(gòu)建過程中使用帶有8-bp隨機標(biāo)簽［13-14］的接頭替代原有接頭。采用特定區(qū)域捕獲探針富集文庫，捕獲區(qū)域中包含HBA和HBB區(qū)域，以及全基因組上2 088個質(zhì)控SNP位點。使用定量試劑和QPCR定量擴增儀（ABI公司StepOnePlus）對文庫DNA進行定量，得到文庫濃度。隨后在博奧生物的BES4000基因測序平臺完成測序。測序數(shù)據(jù)下機后，過濾短序列和低質(zhì)量數(shù)據(jù)，然后使用BWA軟件比對到參考基因組（hg19）。接著，根據(jù)公式1：RReadnumij=Readnumij×{50 0/R e a dn um，將目標(biāo)區(qū)域進行標(biāo)準(zhǔn)化，以--SEA/αα孕婦懷有--SEA/αα胎兒的作為基線，應(yīng)用公式2：RReadnumij=Readnumij×R eadnumi/N]}，計算標(biāo)準(zhǔn)化值。

根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)化值，應(yīng)用貝葉斯模型，公式3：PFn（A/Rationm）=[PFn（Ratiom/A）PFn（Ratiom/A）×PF（nRatiom/B）×PF（nRatiom/C）×PF（nC）]（Fetal fractiom∈Fn），計算胎兒為三種不同基因型（αα/αα，--SEA/αα，--/--）的P值，最終根據(jù)P值來判斷胎兒基因型。

2 結(jié)果

本研究中一共納入22個家系，其中19個家系中夫婦雙方α-地貧基因型均為--SEA/αα，2個家系中一方為-α3.7攜帶者，1個家系為點突變αQS攜帶者。夫婦雙方為--SEA/αα的家系中，按照孟德爾定律，其胎兒將有25%可能性患巴氏胎兒水腫綜合征。

應(yīng)用本研究中的方法，依據(jù)貝葉斯模型的P值，可以通過無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的方法清楚判斷出胎兒為三種基因型（αα/αα，--SEA/αα，--/--），當(dāng)胎兒為其中基因型時，另外兩種基因型的P值則明顯降低。通過與產(chǎn)前診斷結(jié)果進行對比，本研究中無創(chuàng)產(chǎn)前檢測對胎兒地貧基因中所有缺失型的判斷，均與產(chǎn)前診斷結(jié)果保持一致，見表1。

除了能夠準(zhǔn)確判斷胎兒缺失型α-地貧的基因型外，本研究中還發(fā)現(xiàn)可以準(zhǔn)確判斷出父源的地貧點突變型。如家系21中，丈夫攜帶點突變αQS，而在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測數(shù)據(jù)中，αQS對應(yīng)位點的測序深度為198X，且100%均為野生型，可以推斷此胎兒不攜帶父源突變。如家系22中，父方攜帶βCD37/β0，母方攜帶βCD41-42/β0，而無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果提示，βCD37測序深度為268X，而全部均為野生型，推斷此胎兒不攜帶父源突變，若無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果提示，家系22不會生出重型地貧胎兒，可無需進行產(chǎn)前診斷。

3 討論

孕期并發(fā)癥在攜帶巴氏水腫胎的孕婦中是很常見。羊水過多和早產(chǎn)經(jīng)常發(fā)生，其報告發(fā)病率分別高達29%和66%［15］。另一個與胎兒水腫相關(guān)的母體風(fēng)險是鏡像綜合征，這是一種罕見但嚴(yán)重的疾病。Braun等［16］在文獻回顧中指出，在56例鏡像綜合征患者中，母親的主要發(fā)病率為肺水腫，占21%。重度先兆子癇有30%會發(fā)生母親與水腫胎兒共存。產(chǎn)前診斷是早期發(fā)現(xiàn)這種疾病風(fēng)險的必要條件，可以通過有創(chuàng)性胎兒取樣或連續(xù)超聲檢測受累胎兒，然后進行有創(chuàng)性檢測。而自從在母體血漿中發(fā)現(xiàn)cff-DNA以來，cff-DNA已被廣泛應(yīng)用，有望通過母體血漿中的胎兒DNA來無創(chuàng)性的檢測出這類疾病。

目前，利用cffDNA進行地貧基因檢測的研究仍不多［17-18］。Ge等［19］對5對SEA缺失的雜合子α-地中海貧血父母進行了384種不同條形碼的靶區(qū)捕獲測序。以母體血漿相對拷貝率為指標(biāo)，結(jié)合R-score和L-score分析，與正常對照組比較，實現(xiàn)了估計胎兒基因型信號。Wang等［20］對2個家族采用靶向捕獲測序和單倍型輔助分析方法，對東南亞缺失型α地中海貧血基因突變進行了無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。同時，也有團隊?wèi)?yīng)用Taqman實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和熒光定量PCR檢測孕婦血漿進行無創(chuàng)性檢測［21］。上述這些方法可以檢測或排除胎兒中不同于母體基因組的父系遺傳突變，或者評估相對突變劑量或相對單倍型劑量，最終實現(xiàn)胎兒地貧基因的無創(chuàng)性判讀。前面提到的研究已經(jīng)證明了用cffDNA篩查Bart胎兒水腫的潛力。

而本研究中，我們提出了一種基于目標(biāo)區(qū)域捕獲結(jié)合高通量測序的方法，可無創(chuàng)性地判斷胎兒患巴氏水腫綜合征的概率。巴氏胎兒水腫綜合征是由α-地貧基因同源20 kb純合缺失導(dǎo)致的。由于懷有Bart水腫胎的孕婦的等位基因本身是雜合子，她攜帶野生型等位基因和SEA缺失型等位基因的數(shù)量相等。從巴氏水腫胎傳給母體血漿的胎兒DNA僅含有SEA等位基因，會導(dǎo)致母體血漿中SEA等位基因總量增加，因此我們通過建立貝葉斯模型，可以根據(jù)讀取計數(shù)確定胎兒基因型。由于不同胎兒基因型對計數(shù)變化微小，我們通過一組2 088個高變異性SNP作為質(zhì)控，可以實現(xiàn)胎兒計數(shù)精確量化。結(jié)果表明，胎兒基因型的最終確定由胎兒分?jǐn)?shù)和基于貝葉斯模型的計數(shù)統(tǒng)計組成，在所有22個家系中，均與產(chǎn)前診斷結(jié)果完全吻合，具有很高的準(zhǔn)確性。因此，有望通過本研究中的方法對巴氏胎兒水腫綜合征進行無創(chuàng)性地產(chǎn)前檢測，實現(xiàn)避免侵入性操作分析α-珠蛋白基因和排除連續(xù)超聲檢查，更重要的一點，由于胎兒游離DNA在6周的時候就可以在母體血漿中發(fā)現(xiàn)，理論上，無創(chuàng)性地產(chǎn)前檢測可以在妊娠6周進行，早發(fā)現(xiàn)，早診斷。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測通過高深度的測序結(jié)果，可以輕松排除與母體不同的父源點突變。

綜上所述，我們有理由相信無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測地貧基因，可以在判斷缺失型α地貧導(dǎo)致巴氏胎兒水腫綜合征，以及判斷夫婦雙方攜帶不同型地貧基因時，起到非常重要的作用，在孕早期獲得結(jié)果，避免非必要的侵入式取樣。減輕孕婦心理壓力，符合臨床要求。