(廈門金達(dá)威集團(tuán)股份有限公司,福建 廈門 361022)

大腸桿菌遺傳背景清晰、代謝可塑性強(qiáng)、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短,是代謝工程和合成生物學(xué)的最佳宿主生物之一[1]。隨著大腸桿菌基因重組技術(shù)與大腸桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展,重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵已成為發(fā)酵工業(yè)的研究熱點(diǎn)之一[2]。高密度發(fā)酵技術(shù)可以提高基因工程菌的發(fā)酵密度和產(chǎn)物的時(shí)空產(chǎn)率,縮短生產(chǎn)周期,縮小發(fā)酵規(guī)模,降低生產(chǎn)設(shè)備投入,可以極大地提高目的產(chǎn)物在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力[3]。

代謝工程育種通過(guò)針對(duì)性菌株改造獲得目的產(chǎn)物,可以大大提高育種效率與產(chǎn)量[4]。代謝控制發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程,重組大腸桿菌的內(nèi)部代謝調(diào)控機(jī)制和外界環(huán)境(如培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基配方、補(bǔ)料策略及表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)方式),都對(duì)菌體高密度生長(zhǎng)和異源蛋白表達(dá)具有重要影響[5]。目前,重組大腸桿菌高密度發(fā)酵工藝一般都使用天然培養(yǎng)基,其主要氮源為蛋白胨和酵母浸粉[6-11],這些天然培養(yǎng)基成分復(fù)雜,不同生產(chǎn)廠商的產(chǎn)品質(zhì)量差異大,易造成發(fā)酵不穩(wěn)定,且價(jià)格相對(duì)較高,導(dǎo)致發(fā)酵成本較大。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基[12-15]是一種成分明確、價(jià)格低廉的培養(yǎng)基,其操作工藝簡(jiǎn)易且發(fā)酵穩(wěn)定,在重組大腸桿菌工業(yè)化培養(yǎng)中具有極佳的應(yīng)用價(jià)值。六勝肽EEMQRR是一種SNAP-25蛋白N端來(lái)源的衍生肽,由谷氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和精氨酸組成。EEMQRR參與競(jìng)爭(zhēng)SNAP-25在融泡復(fù)合體的位點(diǎn),從而影響復(fù)合體的形成,當(dāng)融泡復(fù)合體稍不穩(wěn)定時(shí),囊泡不能有效釋放神經(jīng)遞質(zhì),從而促使肌肉收縮減弱,防止皺紋的形成。EEMQRR廣泛應(yīng)用在化妝品和護(hù)膚品領(lǐng)域,市場(chǎng)需求巨大。筆者以實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建的表達(dá)活性短肽EEMQRR的重組大腸桿菌作為出發(fā)菌株,對(duì)其無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵工藝進(jìn)行研究,為該工藝推廣至大腸桿菌重組表達(dá)其他相關(guān)產(chǎn)物提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

菌種為E.coliBL21(DE3);活性短肽EEMQRR基因及表達(dá)質(zhì)粒pET-30a由筆者實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培 養(yǎng) 基

活化培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉10 g/L,采用10%氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7。

種子培養(yǎng)基:氯化鈉3.5 g/L,酵母浸粉10 g/L,葡萄糖1 g/L,磷酸氫二鉀3.68 g/L,磷酸二氫鉀1.32 g/L,采用10%氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7,滅菌條件為115 ℃,30 min。

TB培養(yǎng)基:蛋白胨12 g/L,酵母提取物24 g/L,磷酸氫二鉀12.54 g/L,磷酸二氫鉀2.31 g/L,甘油4 mL/L。

有機(jī)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖25 g/L,蛋白胨35 g/L,酵母浸粉7.5 g/L,氯化銨6.7 g/L,磷酸氫二鈉22.3 g/L,磷酸二氫鉀8.5 g/L,硫酸鎂1.25 g/L,硫酸鈉1.8 g/L。其中葡萄糖、硫酸鎂單獨(dú)115 ℃,15 min滅菌;其余組分滅菌條件為121 ℃,20 min;滅菌后用氨水調(diào)整pH至7。

有機(jī)補(bǔ)料培養(yǎng)基:酵母浸粉50 g/L,蛋白胨25 g/L,葡萄糖400 g/L,硫酸鎂4 g/L:葡萄糖、硫酸鎂單獨(dú)115 ℃,15 min滅菌;其余組分滅菌條件為121 ℃,20 min;消毒后合并補(bǔ)料。

無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母浸粉4 g/L,磷酸氫二銨4 g/L,硫酸鎂0.8 g/L,檸檬酸1.7 g/L,硫酸鈉3 g/L,100×微量元素溶液6.6 mL/L,維生素B120 mg/L。其中微量元素溶液和維生素B1過(guò)濾除菌,于發(fā)酵前加入;葡萄糖單獨(dú)115 ℃,15 min滅菌;其余組分滅菌條件為121 ℃,20 min;滅菌后用氨水調(diào)整pH至7。

100×微量元素溶液:檸檬酸鐵10 g/L,四水合氯化錳1.5 g/L,六水合氯化鈷0.25 g/L,二水合鉬酸鈉0.25 g/L,二水合氯化銅0.15 g/L,二水合醋酸鋅1.3 g/L,硼酸0.3 g/L,乙二胺四乙酸0.84 g/L,純水溶解后定容至1 L,過(guò)濾除菌,4 ℃保藏。

無(wú)機(jī)鹽補(bǔ)料培養(yǎng)基:葡萄糖700 g/L,硫酸鎂4 g/L,100×微量元素溶液2 mL/L,維生素B10.5 g/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌種活化

取凍存于-80 ℃的甘油菌,用接種環(huán)沾取后在活化培養(yǎng)基上均勻劃線,于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜,獲得單克隆菌體。

1.3.2 種子培養(yǎng)

接種環(huán)挑取活化的單克隆菌體,接種至10 mL活化培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。以5%的接種量(以體積計(jì),下同)將活化培養(yǎng)基接種至150 mL種子培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600為1～1.5。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵

活化培養(yǎng)基以5%的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL TB培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8,加入終濃度為0.08 mmol/L的IPTG,誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。

1.3.4 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝

按照5%的接種量將種子培養(yǎng)基接入滅菌后的無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中,二者混合后總體積為3 L。發(fā)酵罐溫度全程控制在30 ℃,pH用氨水調(diào)節(jié)至7并維持在該水平,通過(guò)轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量交替調(diào)整控制溶氧為20%～30%。發(fā)酵前期流加補(bǔ)料培養(yǎng)基并控制葡萄糖質(zhì)量濃度為1～3 g/L,當(dāng)OD600為70～80時(shí),先加入1 g/L的酵母浸粉溶液,再加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG開始誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)后使用DO-stat補(bǔ)料方式,30 ℃培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化

通過(guò)研究發(fā)酵培養(yǎng)基類型、碳源、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、銨離子濃度和有機(jī)氮源等因素對(duì)活性短肽EEMQRR表達(dá)的影響,以獲得最佳發(fā)酵表達(dá)條件。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度和生物量測(cè)定

葡萄糖質(zhì)量濃度通過(guò)西爾曼M-100生物傳感器分析儀測(cè)定;生物量以UV-8000分光光度計(jì)測(cè)量菌液在600 nm波長(zhǎng)下的吸光度OD600表征。

1.4.2 發(fā)酵液中銨離子濃度測(cè)定

銨離子濃度根據(jù)苯酚-次氯酸鹽方法(Berthelot反應(yīng))測(cè)定,具體操作條件和步驟參考文獻(xiàn)[16]。

1.4.3 活性短肽EEMQRR表達(dá)分析

發(fā)酵結(jié)束后收集菌體,經(jīng)Avestin納米級(jí)超高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體并離心,獲得菌體全菌裂解液、裂解液上清和裂解液沉淀。全菌裂解液和裂解液沉淀中所含的目標(biāo)包涵體可用緩沖液(尿素8 mol/L、tris-HCl 50 mmol/L、NaCl 200 mmol/L、咪唑25 mmol/L,pH 7.2)重懸溶解為可溶性蛋白,用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白,并利用ImageJ軟件分析目的產(chǎn)物在全菌裂解液中的純度。

1.4.4 活性短肽EEMQRR表達(dá)量檢測(cè)

首先,分別取BSA標(biāo)準(zhǔn)品(2 mg/mL)0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 μL至96孔酶標(biāo)板中;然后,將供試樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)后取1 μL至酶標(biāo)板中,重復(fù)3孔;最后,各孔加入200 μL考馬斯亮藍(lán)染色液反應(yīng)。用multiskan go酶標(biāo)儀測(cè)定A595吸光值,依據(jù)A595繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算供試樣品全菌裂解液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,結(jié)合1.4.3節(jié)目的產(chǎn)物在全菌裂解液中的純度,計(jì)算出目的產(chǎn)物的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶發(fā)酵表達(dá)

大腸桿菌表達(dá)目的蛋白液定位在胞內(nèi)、胞外和周質(zhì)3個(gè)腔內(nèi)。根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的定位,目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式一般分為胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá),以胞內(nèi)表達(dá)為主要形式,胞內(nèi)產(chǎn)物可分為可溶性表達(dá)和不溶性的包涵體形式。

筆者初步設(shè)想通過(guò)實(shí)現(xiàn)活性多肽包涵體,得到多倍體的不溶性串聯(lián)多肽,經(jīng)過(guò)復(fù)性后用特異性胰蛋白酶降解活性多肽,純化獲得活性單肽。首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建成功的BL21(DE3)/pET30a-EEMQRR(32倍體和48倍體)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證,然后對(duì)產(chǎn)物EEMQRR在大腸桿菌中表達(dá)情況進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1(a,b)所示。由圖1(a)可知:筆者構(gòu)建的活性短肽EEMQRR的32倍體和48倍體均在重組大腸桿菌中有高效表達(dá),表達(dá)量及純度隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。SDS-PAGE電泳顯示:2個(gè)蛋白分子量大小分別約為30,50 kD,與設(shè)計(jì)序列分子量大小相符。經(jīng)ImageJ軟件分析,EEMQRR 32倍體的質(zhì)量約占總蛋白的47.7%,EEMQRR 48倍體的質(zhì)量約占總蛋白的57.1%,基于產(chǎn)物效率及表達(dá)純度,優(yōu)先選擇EEMQRR 48倍體菌株作為后續(xù)5 L罐無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵菌種。由圖1(b)可知:活性短肽EEMQRR多倍體均以包涵體的形式表達(dá),符合筆者設(shè)想,可以為后續(xù)蛋白質(zhì)純化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

M—Marker泳道;1—誘導(dǎo)前樣品;2—EEMQRR(32倍體)誘導(dǎo) 2 h;3—EEMQRR(32倍體)誘導(dǎo)4 h;4—EEMQRR(32倍體) 誘導(dǎo)6 h;5—EEMQRR(48倍體)誘導(dǎo)2 h;6—EEMQRR(48倍體)誘導(dǎo)4 h;7—EEMQRR(48倍體)誘導(dǎo)6 h。

2.2 5 L發(fā)酵罐無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基驗(yàn)證及工藝研究

重組大腸桿菌搖瓶發(fā)酵表達(dá)活性肽由于受溶氧、補(bǔ)料、誘導(dǎo)方式及發(fā)酵條件等各種因素限制,往往達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的水平。在確認(rèn)搖瓶工藝條件后,通過(guò)5 L發(fā)酵罐發(fā)酵對(duì)主要影響因素進(jìn)行研究,以提高產(chǎn)量、優(yōu)化成本,簡(jiǎn)化操作工藝,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。

2.2.1 活性短肽工程菌的5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵

為了評(píng)估活性短肽EEMQRR規(guī)模化生產(chǎn)的潛力,在5 L發(fā)酵罐中對(duì)EEMQRR 48倍體進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分明確,在營(yíng)養(yǎng)匱乏的情況下,大腸桿菌會(huì)不斷合成體內(nèi)所需的氨基酸,從而為活性短肽的高效合成提供機(jī)會(huì)。相較于無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基,營(yíng)養(yǎng)豐富的有機(jī)培養(yǎng)基是常規(guī)高密度發(fā)酵的基礎(chǔ)。筆者對(duì)兩個(gè)不同發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵工藝進(jìn)行比較,發(fā)酵結(jié)果如圖2(a,b)所示。由圖2(a,b)可知:1) 有機(jī)培養(yǎng)基在高密度發(fā)酵誘導(dǎo)前已經(jīng)提前泄漏表達(dá),發(fā)酵24 h的OD600為77.56,放罐終點(diǎn)表達(dá)量為4.4 g/L;2) 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中基本無(wú)泄漏表達(dá),發(fā)酵12 h時(shí)OD600達(dá)到75.72,隨后加入IPTG開始誘導(dǎo),誘導(dǎo)后OD600仍持續(xù)增長(zhǎng),放罐終點(diǎn)時(shí)OD600達(dá)到了145.8,且表達(dá)量可達(dá)12.72 g/L,優(yōu)勢(shì)明顯。該工藝經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室重復(fù)驗(yàn)證,結(jié)果表明其穩(wěn)定可行。

圖2 5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵情況

2.2.2 碳源選擇實(shí)驗(yàn)

在重組大腸桿菌分批補(bǔ)料發(fā)酵時(shí),葡萄糖和甘油是最常用的兩種碳源。理論上當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)容易產(chǎn)生乙酸,從而影響大腸桿菌的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá),所以在使用葡萄糖為碳源時(shí),一般采用限制流加方式來(lái)補(bǔ)料。為降低葡萄糖產(chǎn)乙酸的效應(yīng),部分實(shí)驗(yàn)采用甘油替代葡萄糖作為碳源。在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別以甘油和葡萄糖作為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)并比較,結(jié)果如圖3所示。在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中以甘油為碳源時(shí),OD600很難達(dá)到理想值,最高增長(zhǎng)到約25就停滯不前,不符合高密度發(fā)酵要求,也無(wú)法實(shí)現(xiàn)高產(chǎn),故筆者在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇葡萄糖作為唯一分批補(bǔ)料發(fā)酵的碳源。

圖3 5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵碳源實(shí)驗(yàn)

2.2.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)選擇

在重組大腸桿菌表達(dá)活性短肽EEMQRR 48倍體的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中,OD600達(dá)到80時(shí)屬于該菌株對(duì)數(shù)中后期,比生長(zhǎng)速率μ>1,發(fā)酵結(jié)束時(shí)OD600>140,目的產(chǎn)物表達(dá)量達(dá)到12.72 g/L。在OD600為25～30時(shí)開始誘導(dǎo),OD600最高為54,由于誘導(dǎo)過(guò)早,造成菌體代謝負(fù)擔(dān)較早過(guò)重,重組質(zhì)粒丟失,表達(dá)量較低。在OD600為50～60時(shí)誘導(dǎo),表達(dá)量較OD600為25～30時(shí)明顯提高,不過(guò)仍無(wú)法與OD600為70～80時(shí)相比。為獲得活性多肽的最高產(chǎn)量,綜合考慮發(fā)酵菌體得率和活性短肽表達(dá)量,選擇在OD600為70～80時(shí)開始誘導(dǎo),發(fā)酵結(jié)果如圖4(a,b)所示。

圖4 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)菌體生長(zhǎng)和活性短肽表達(dá)的影響

2.2.4 銨離子濃度優(yōu)化

圖5 不同銨根離子濃度對(duì)活性短肽發(fā)酵的影響

2.2.5 有機(jī)氮源的影響

蛋白胨和酵母浸粉是重組大腸桿菌高密度發(fā)酵中最常用的2種有機(jī)氮源,雖然它們能為基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)提供豐富的營(yíng)養(yǎng),但是它們成分不明確,并且用量大、價(jià)格高,不利于工業(yè)化成本控制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:有機(jī)培養(yǎng)基中蛋白胨的存在促使重組大腸桿菌在加入IPTG誘導(dǎo)前已泄漏表達(dá),最終造成活性短肽產(chǎn)量低,而無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基則沒(méi)有出現(xiàn)該情況,結(jié)果如圖6(a,b)所示。因此,以氨水作無(wú)機(jī)氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基,其成分和用量明確,原料價(jià)格低廉,適合重組大腸桿菌表達(dá)活性短肽。重組大腸桿菌在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵時(shí)存在前期起步較慢,中后期菌體發(fā)生自溶的現(xiàn)象。進(jìn)一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)顯示:在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基基礎(chǔ)上適量添加有機(jī)氮源,即在發(fā)酵初始和誘導(dǎo)時(shí)分別加入4 g/L和1 g/L酵母浸粉,有利于促進(jìn)前期菌體生長(zhǎng)和避免中后期自溶,可以提升發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性。

M—Marker泳道;1—誘導(dǎo)前樣品;2—EEMQRR(48倍體) 誘導(dǎo)3 h;3—EEMQRR(48倍體)誘導(dǎo)17 h。

3 結(jié) 論

以活性短肽為目的產(chǎn)物,從搖瓶發(fā)酵出發(fā),經(jīng)SDS-PAGE電泳計(jì)算出活性短肽EEMQRR 48倍體的表達(dá)量占總蛋白的57.1%,其表達(dá)形式為胞內(nèi)包涵體;通過(guò)在5 L發(fā)酵罐對(duì)BL21(DE3)/pET30a-EEMQRR進(jìn)行有機(jī)培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的高密度發(fā)酵對(duì)比,確立無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì);先后考察碳源、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、銨離子濃度和有機(jī)氮源等重要因素對(duì)EEMQRR 48倍體表達(dá)的影響,確定無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳發(fā)酵工藝。最佳發(fā)酵工藝：以葡萄糖為唯一碳源,當(dāng)OD600為70～80時(shí)開始誘導(dǎo),發(fā)酵過(guò)程中銨離子最適濃度為152 mmol/L且不能積累超過(guò)228 mmol/L,同時(shí)在發(fā)酵初始和誘導(dǎo)時(shí)分別加入4 g/L和1 g/L酵母浸粉以提高發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性。研究結(jié)果為活性短肽的產(chǎn)業(yè)化提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù),并且通過(guò)多批次發(fā)酵證明了無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵工藝的可重復(fù)性和高效性,該工藝具有推廣至重組大腸桿菌高效表達(dá)其他目的蛋白的商業(yè)化價(jià)值。