(1.吉林梅花氨基酸有限責(zé)任公司,吉林 白城 137000;2.通遼梅花生物科技有限公司,內(nèi)蒙古 通遼 028024)

經(jīng)亞硫酸溶液浸漬后,玉米種皮內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽和糖等透過種皮浸漬入水中形成稀漿,將稀漿濃縮即可制得玉米漿[1]。玉米漿是玉米濕法加工生產(chǎn)淀粉糖的主要副產(chǎn)物之一,除含有豐富的氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和微量元素,還含有VB1、VB2、生物素和一些前體物質(zhì)[2]。作為有機(jī)氮源,玉米漿在發(fā)酵過程中為菌體生長提供氮元素和必要的生長因子,用于構(gòu)成菌體核酸、蛋白質(zhì)和維生素等含氮物質(zhì)和含氮代謝產(chǎn)物,對菌體生長和代謝產(chǎn)物的合成起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[3-5]。因此,準(zhǔn)確測定玉米漿中游離氨基酸濃度具有重要意義。

由于大部分氨基酸分子不含有紫外吸收官能團(tuán),所以一般先將氨基酸進(jìn)行柱前衍生再進(jìn)行定性定量分析,該類方法是目前測定氨基酸的主要方法。衍生化試劑主要有熒光胺(FA)[6]、鄰苯二甲醛(OPA)[7-8]、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)[9-10]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[11-12]、異硫氰酸苯酯(PITC)[13-15]、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)[16-17]和6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC)[18-19]。由于玉米漿中的氨基酸種類繁多且結(jié)構(gòu)相近,所以使用單一衍生試劑難以滿足同時對所有一、二級氨基酸分離的要求,難以達(dá)到定性和精確定量的目的。因此,筆者通過建立基于OPA-FMOC雙衍生劑的HPLC法,實現(xiàn)對玉米漿中所有一、二級游離氨基酸的定性和精確定量分析。所有一級氨基酸先與OPA反應(yīng),生成異吲哚類物質(zhì),在338 nm處有最大吸收[20];一級氨基酸全部反應(yīng)完全后,加入FMOC與二級氨基酸反應(yīng),產(chǎn)物在262 nm處有最大吸收[20]。因為FMOC衍生物(即FMOC與二級氨基酸反應(yīng)產(chǎn)物)比任何OPA衍生物(上述異吲哚類物質(zhì))的疏水性都強(qiáng),所以它不會干擾任何一級氨基酸的檢測,經(jīng)高效液相分離后根據(jù)保留時間進(jìn)行定性,利用外標(biāo)法定量。

1 材料和方法

1.1 材 料

玉米漿,通遼梅花生物科技有限公司自產(chǎn)。

1.2 試 劑

乙腈、甲醇,色譜純;濃度分別為25,100,250,1 000 pmol/μL的17種氨基酸混標(biāo)、OPA、FMOC、硼酸緩沖液,Agilent Technologies;蒸餾水;二水合磷酸二氫鈉、NaOH,國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀1260,Agilent Technologies;電子天平(萬分之一)、pH計,METTLER TOLEDO儀器有限公司;50 mL容量瓶、1 L玻璃燒杯、超純水機(jī)、真空泵、溶劑過濾器、磁力攪拌器，市購。

1.4 方法條件

流動相為40 mmol/L的NaH2PO4水溶液,用濃度為10 mol/L的NaOH調(diào)pH=7.8,過膜超聲后為流動相A;V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(超純水)=45∶45∶10,超聲混勻后為流動相B。

衍生劑為V(OPA)∶V(FMOC)∶V(樣品)=0.5∶0.5∶1;色譜柱型號ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×75 mm 3.5-Micron;柱溫設(shè)為40 ℃;VWD波長分別為338,262 nm。

OPA衍生氨基酸反應(yīng)方程式為

FMOC衍生氨基酸反應(yīng)方程式為

化學(xué)工作站程序設(shè)置如表1所示。

表1 流動相工作程序

2 結(jié)果與分析

2.1 分離條件優(yōu)化

2.1.1 衍生劑用量對氨基酸分離的影響

對V(OPA)∶V(FMOC)∶V(樣品)分別為0.2∶0.2∶1,0.5∶0.5∶1,1∶1∶1的衍生劑進(jìn)行氨基酸標(biāo)品分析,色譜圖結(jié)果表明:當(dāng)衍生劑加入量分別為0.5,1 μL時,各衍生物峰面積值一致,說明衍生反應(yīng)徹底,可以得出準(zhǔn)確結(jié)果;當(dāng)衍生劑加入量為0.2 μL時,峰面積偏小,計算結(jié)果偏低,說明不能將樣品中的氨基酸完全衍生化。為達(dá)到完全衍生及提高衍生劑利用率的目的,最終采用衍生劑為V(OPA)∶V(FMOC)∶V(樣品)=0.5∶0.5∶1。

2.1.2 流動相濃度對氨基酸分離的影響

配制濃度分別為10,40,100 mmol/L的NaH2PO4水溶液,用濃度為10 mol/L的NaOH調(diào)pH=7.8,進(jìn)行氨基酸混合標(biāo)品分析。色譜圖結(jié)果表明:當(dāng)濃度為40 mmol/L時,分離度>1.5,峰型好,峰面積適中,為最佳流動相濃度;低濃度流動相(10 mmol/L)時的氨基酸的基線峰寬大,分離度差,測量誤差大;高濃度流動相(100 mmol/L)時的氨基酸基線，雖然峰型好,分離度適中,但有鹽析出，易造成堵塞,對色譜柱、儀器損傷大。因此,筆者最終采用的濃度為40 mmol/L NaH2PO4水溶液作為流動相。

2.1.3 流速對氨基酸分離的影響

對不同流速(1.5,2,2.5 mL/min)的氨基酸混合標(biāo)品進(jìn)行分析,色譜圖結(jié)果表明:最佳的流動相流速為2 mL/min;低流速流動相(1.5 mL/min)時的氨基酸分離時間長,色譜峰拖尾;高流速流動相(2.5 mL/min)時的氨基酸保留時間間隔短,峰易重疊,且柱壓高,對色譜柱、儀器損傷較大。因此,筆者最終采用流速為2 mL/min。

2.1.4 最佳分離條件下的色譜圖

綜合以上3個因素,擇定分離條件:流動相A為40 mmol/L的NaH2PO4水溶液,pH=7.8;流動相B為V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10;衍生劑為V(OPA)∶V(FMOC)∶V(樣品)=0.5∶0.5∶1;流速為2 mL/min。該條件下可以達(dá)到最佳分離效果,氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100 pmol/μL。最佳條件下的色譜圖如圖1所示。

1—天冬氨酸;2—谷氨酸;3—絲氨酸;4—組氨酸;5—甘氨酸;6—蘇氨酸;7—精氨酸;8—丙氨酸;9—酪氨酸;10—半胱氨酸; 11—纈氨酸;12—蛋氨酸;13—苯丙氨酸;14—異亮氨酸;15—亮氨酸;16—賴氨酸;17—脯氨酸。

由圖1知:在最佳分離條件下,17種氨基酸混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品在10 min內(nèi)可完全分離開,分離度良好;在信號強(qiáng)度為0～10 mAu時,峰面積適中,峰型好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

依次檢測4個氨基酸混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為25,100,250,1 000 pmol/μL),使用Agilent化學(xué)工作站對各色譜峰進(jìn)行積分,獲得各峰的峰面積,以各濃度對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù),具體結(jié)果如表2所示。

表2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

由表2可知:當(dāng)濃度為25～1 000 pmol/μL時,17種氨基酸混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的線性相關(guān)系數(shù)均在0.999以上,說明相關(guān)性良好。

2.3 精密度考察

對濃度為100 pmol/μL的混標(biāo)連續(xù)5次進(jìn)樣,獲得17種氨基酸的保留時間的相對平均偏差RSD和峰面積的RSD(n=5),結(jié)果如表3所示。

表3 新方法峰面積和保留時間的精密度

由表3可知:17種氨基酸的保留時間的RSD為0.01%～0.15%,峰面積的RSD(n=5)為2.03%～3.17%,表明新方法的重現(xiàn)性較好,精密度較高。

2.4 對比實驗

將玉米漿樣品分成2份：1份樣品送至專業(yè)檢測單位(梅花集團(tuán),廊坊市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)華祥路66號),利用氨基酸分析儀測定氨基酸質(zhì)量濃度，具體參考GB/T 30987—2020《植物中游離氨基酸的測定》；另1份樣品使用新方法測定氨基酸質(zhì)量濃度。

對2份樣品進(jìn)行對比實驗,結(jié)果如表4所示。

表4 新方法與氨基酸分析儀結(jié)果對比

由表4可知:采用新方法與利用氨基酸分析儀檢測所得數(shù)據(jù)基本一致,故可以將新方法應(yīng)用于玉米漿中游離氨基酸濃度的檢測。

2.5 加標(biāo)回收實驗

取玉米漿1份,稀釋50倍過膜,與濃度為1 000 pmol/μL的混合標(biāo)準(zhǔn)液按體積比1∶1混勻后依次衍生化進(jìn)樣分析,得到各氨基酸加標(biāo)回收率,結(jié)果如表5所示。

表5 玉米漿加標(biāo)回收結(jié)果

由表5可知:通過對比5種樣本,發(fā)現(xiàn)17種氨基酸加標(biāo)回收率為90.16%～104.55%(表5中只列出樣1加標(biāo)回收率,其余4種樣本加標(biāo)回收率未列出,皆在95%～105%范圍內(nèi)),回收率高,說明新方法適合被測基質(zhì)(即玉米漿)中游離氨基酸濃度的檢測。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合樣與玉米漿樣的疊加色譜圖如圖2所示。圖2中：曲線外圈為玉米漿,內(nèi)部為氨基酸混標(biāo)。

1—天冬氨酸;2—谷氨酸;3—絲氨酸;4—組氨酸;5—甘氨酸;6—蘇氨酸;7—精氨酸;8—丙氨酸;9—酪氨酸;10—半胱氨酸; 11—纈氨酸;12—蛋氨酸;13—苯丙氨酸;14—異亮氨酸;15—亮氨酸;16—賴氨酸;17—脯氨酸;A—峰面積30.044 7; B—峰面積89.423 8;C—峰面積68.297 4;D—峰面積1.683 42。

由圖2可知:玉米漿中的氨基酸有一級氨基酸天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸,二級氨基酸脯氨酸。說明玉米漿中氨基酸種類多,營養(yǎng)豐富,作為有機(jī)氮源,在發(fā)酵過程中對菌體生長和代謝產(chǎn)物合成起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié) 論

通過建立基于OPA-FMOC的雙衍生劑HPLC法,實現(xiàn)對玉米漿中所有一、二級游離氨基酸的定性和精確定量分析。確定最佳衍生劑配比為V(OPA)∶V(FMOC)∶V(樣品)=0.5∶0.5∶1;最佳色譜條件:色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×75 mm 3.5-Micron,柱溫為40 ℃;流動相A為40 mmol/L的NaH2PO4水溶液,pH=7.8;流動相B為V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10;流速為2 mL/min,梯度洗脫;流速為2 mL/min;VWD波長分別為338,262 nm。在該條件下,所測得17種氨基酸混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的線性相關(guān)系數(shù)均在0.999以上,保留時間的RSD為0.01%～0.15%,峰面積的RSD為2.03%～3.17%,樣品加標(biāo)回收率為90%～105%。新方法具有操作步驟簡單、高效、穩(wěn)定性好、靈敏度高、分離效能好和精密度較高等優(yōu)點,可以用于對玉米漿中游離氨基酸濃度的測定。