鄭毅，趙彤

（1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 牙體牙髓科，天津 300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科，天津 300021）

牙槽骨缺損是指上下頜骨邊緣鑲嵌牙根處因牙周炎、創(chuàng)傷或腫瘤等因素導(dǎo)致該處骨組織受損。牙槽骨受損嚴(yán)重時(shí)，牙周組織支持力量減弱，牙齒松動(dòng)甚至脫落，因此牙槽骨缺損的修復(fù)對(duì)口腔疾病患者至關(guān)重要。臨床上無機(jī)材料、復(fù)合材料和自體牙骨移植材料常被用來修復(fù)牙槽骨缺損[1]。廖武堂[2]研究結(jié)構(gòu)顯示，Bio-Oss 骨粉結(jié)合豬小腸黏膜下層也可促進(jìn)牙槽骨組織的再生，有效修復(fù)牙槽骨缺損。但很多牙槽骨缺損患者同時(shí)合并糖尿病，在高糖環(huán)境下，骨代謝紊亂[3]，牙槽骨缺損難以愈合，因此糖尿病患者的牙槽骨缺損修復(fù)是口腔科面臨的難點(diǎn)之一。目前，尚未有針對(duì)糖尿病患者牙槽骨缺損修復(fù)的有效方法。

NLR家族Pyrin域蛋白3（NOD-like receptor 3,NLRP3）在糖尿病病程中扮演著重要角色。既往研究顯示，抑制NLRP3 炎癥小體可以加速糖尿病模型小鼠足部潰瘍傷口的愈合[4]，但目前暫未見研究報(bào)道NLRP3 炎癥小體的活性與糖尿病大鼠牙槽骨缺損愈合的關(guān)系。因此本實(shí)驗(yàn)探究抑制NLRP3 炎癥小體糖尿病大鼠牙槽骨缺損愈合情況，以期為臨床尋找治療方案提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4 月齡健康SD 雄性大鼠30只，體重（220±20）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2019-0003。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，正常飲食、飲水。

1.1.2 主要試劑鏈脲佐菌素（上海源葉生物科技有限公司），NLRP3、Caspase-1、白細(xì)胞介素1β（Interleukin,IL-1β）、β-actin 兔抗大鼠一抗、HPR 標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗（美國Abcam 公司），護(hù)骨因子（osteoprotegerin,OPG）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）ELISA 試劑盒（上海瑞番生物科技有限公司），抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TARP）染色試劑盒（上海一研生物科技有限公司），Hifair?V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit試劑盒、Trieasy?Total RNA Extraction Reagent TRIeasy?總RNA 提取試劑盒（上海翌圣生物科技有限公司），NLRP3 炎癥小體抑制劑（YQ128）、動(dòng)物組織蛋白抽提試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司），高糖飼料（上海銳賽生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 主要儀器血糖儀BGM501（上海寰熙醫(yī)療器械有限公司），多樣品組織研磨儀CEBO-24（上海測(cè)博生物科技發(fā)展中心），全自動(dòng)酶標(biāo)儀318C+（上海沛歐分析儀器有限公司），Qubit 熒光定量儀、SimpliAmp PCR 儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），80i 顯微鏡（日本Nikon 公司），一體式凝膠成像系統(tǒng)WD-9413D、轉(zhuǎn)印電泳儀DYCZ-40K（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型大鼠的復(fù)制高糖飼料飼養(yǎng)4 周后，大鼠腹腔注射0.1 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉稀釋的鏈脲佐菌素60 mg/kg。72 h 后用一次性測(cè)血糖針刺破大鼠尾尖取血（測(cè)量前12 h 禁食），用血糖儀檢測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L 為糖尿病模型復(fù)制成功[5]。

將復(fù)制成功的糖尿病模型大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，分離口腔上頜兩側(cè)第一磨牙腭側(cè)的牙齦與粘骨膜，用球鉆緩慢由近中向遠(yuǎn)中磨除部分牙槽骨骨質(zhì)，形成大小約2.0 mm×2.0 mm×1.0mm 的缺口，磨除的同時(shí)注意用生理鹽水沖洗冷卻，縫合牙齦。

<1)，且各件產(chǎn)品是否為不合格品相互獨(dú)立．

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥將30 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組，每組10 只。模型復(fù)制成功后，炎癥小體抑制組大鼠立即尾靜脈注射20 mg/kg NLRP3 抑制劑（YQ128），1 次/d，連續(xù)給藥28 d。對(duì)照組和模型組大鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)注射28 d。

1.2.3 空腹血糖檢測(cè)給藥結(jié)束后大鼠禁食12 h，用一次性測(cè)血糖針刺大鼠尾部取血，血糖儀測(cè)量各組大鼠空腹血糖。

1.2.4 骨代謝指標(biāo)檢測(cè)測(cè)量血糖后，大鼠尾靜脈采血，1 000 r/min 離心10 min，取上清液采用ELISA檢測(cè)OPG 和ALP 含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀讀數(shù)，將光密度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)孔位濃度。

1.2.5 牙槽骨缺損區(qū)蘇木精-伊紅（hematoxylineosin,HE）染色及Lane-Sandhu 評(píng)分采血后，處死各組大鼠，取左側(cè)上頜骨復(fù)制缺損處的骨組織于多聚甲醛中固定24 h，然后置于100 g/L 乙二胺四乙酸溶液中脫鈣處理10周，每2 天換脫鈣液1 次。脫鈣后取出骨組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，蠟塊切片約4 μm厚，進(jìn)行HE 染色，顯微鏡下觀察牙槽骨愈合情況。根據(jù)Lane-Sandhu 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]評(píng)價(jià)再生情況，包括：①骨形成。無骨形成計(jì)0分，骨形成占骨缺損＞0%～25%計(jì)1分，骨形成占骨缺損＞25%～50%計(jì)2分，骨形成占骨缺損＞50%～75%計(jì)3分，骨形成占骨缺損＞75%～100%計(jì)4 分。②骨連接。骨折線清晰計(jì)0分，骨折線部分存在計(jì)1分，骨折線消失計(jì)2 分。③骨塑形。未見塑形計(jì)0分，髓腔形成計(jì)為2分，皮質(zhì)骨形成計(jì)4 分。

1.2.6 TARP 染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)參照WU等[7]檢測(cè)方法，取1.2.5 中石蠟切片，加入蒸餾水水化脫蠟，采用TARP 染色試劑盒染色，蓋好蓋玻片，放入烘箱內(nèi)烘干，用顯微鏡觀察破骨細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取6 個(gè)視野進(jìn)行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)（不規(guī)則長條形，胞漿呈紅色），計(jì)算平均值。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA的表達(dá)取大鼠右側(cè)上頜骨復(fù)制缺損處的骨組織，剔除牙周軟組織后放入盛有液氮的研缽中，研磨成粉末，取100 mg粉末于離心管中，加入裂解液，室溫下裂解5 min后離心，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。取5 μL提取好的mRNA，按照試劑盒添加其余組分，加無菌無酶水補(bǔ)至30 μL，放入qRT-PCR 儀中。50℃、10min將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火30s，共45 個(gè)循環(huán)。β-actin 作為內(nèi)參，根據(jù)Ct 值計(jì)算2-ΔΔCt。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.8 Western blotting 檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白的表達(dá)取1.2.7 中研磨好的骨組織粉末，在冰上加入蛋白提取試劑盒中的裂解液，于渦旋儀上混勻后離心，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE 進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后，浸泡于轉(zhuǎn)膜液中將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 轉(zhuǎn)膜紙上，放入3%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，加入一抗室溫下孵育過夜，洗膜，加入二抗孵育1 h，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光觀察，以β-actin 作為內(nèi)參計(jì)算灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.00 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空腹血糖的比較

對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠空腹血糖分別為（5.27±1.08）mmol/L、（18.74±4.17）mmol/L 和（18.08±3.98）mmol/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.008，P=0.014），與對(duì)照組比較，模型組與炎癥小體抑制組空腹血糖均上升（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較

對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠OPG、ALP 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.278和1.202，P=0.024 和0.316），模型組OPG、ALP 低于對(duì)照組和炎癥小體抑制組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠OPG和ALP含量比較（n=10，）

表2 各組大鼠OPG和ALP含量比較（n=10，）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

2.3 各組大鼠牙槽骨HE 染色及Lane-Sandhu 評(píng)分比較

HE 染色結(jié)果顯示，模型組大鼠牙槽骨缺損嚴(yán)重，可見大量炎癥浸潤細(xì)胞，炎癥小體抑制組牙槽骨缺損程度低，炎癥浸潤細(xì)胞較少。見圖1。

圖1 各組大鼠上頜骨組織（HE染色×400）

對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠Lane-Sandhu 評(píng)分分別為（6.45±0.97）分、（3.98±0.61）分和（5.02±0.85）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.666，P=0.000），模型組Lane-Sandhu 評(píng)分低于對(duì)照組和炎癥小體抑制組（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)比較

TARP 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)分別為（1.01±0.03）個(gè)/HP、（11.24±2.21）個(gè)/HP 和（8.01±1.68）個(gè)/HP，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=106.447，P=0.000），模型組破骨細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組和炎癥小體抑制組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠上頜骨組織（TARP染色×200）

2.5 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.175、18.414 和23.672，P=0.001、0.000 和0.000），模型組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和炎癥小體抑制組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，）

表3 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

2.6 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.121、12.333 和10.932，P=0.001、0.000 和0.002），模型組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和炎癥小體抑制組（P＜0.05）。見表4和圖3。

表4 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，）

表4 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

圖3 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達(dá)

3 討論

牙槽骨位于上下頜骨邊緣處鑲嵌牙齦的位置，是上下頜骨的牙槽突出部分。一般情況下，隨著年齡的增長及牙齒的不斷咀嚼擠壓會(huì)導(dǎo)致牙槽骨不斷吸收，高度下降；另外，在牙周炎等一些病理或外力的作用下，也會(huì)導(dǎo)致牙槽骨的缺損[8]。納米羥基磷灰石、類骨質(zhì)羥磷灰石等材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人工修復(fù)牙槽骨缺損中[9]。但臨床治療中發(fā)現(xiàn)，牙槽骨缺損糖尿病患者接受治療后，高血糖導(dǎo)致骨愈合緩慢甚至出現(xiàn)不愈合，造成人工修復(fù)失敗，患者面臨失牙風(fēng)險(xiǎn)。有研究顯示，炎癥因子在糖尿病大鼠骨折愈合中發(fā)揮重要作用[10]，NLRP3 炎癥小體是各種炎癥反應(yīng)的重要部分[11]，因此探究抑制NLRP3 炎癥小體對(duì)糖尿病大鼠牙槽骨缺損愈合的影響具有重要的臨床意義。

牙槽骨缺損愈合過程也就是局部骨重建的過程，即破骨細(xì)胞釋放酸液溶解舊骨，成骨細(xì)胞分泌骨膠原形成新骨，兩種作用保持動(dòng)態(tài)的平衡[12]，但糖尿病會(huì)引起患者機(jī)體骨代謝紊亂[13]，破骨細(xì)胞被激活，成骨細(xì)胞受到抑制，導(dǎo)致骨愈合受阻，牙槽骨缺損難以愈合。OPG 和ALP 是典型的骨形成標(biāo)志[14-15]，OPG 又被稱為破骨細(xì)胞分化因子。有研究顯示，抑制OPG 的活性會(huì)降低破骨細(xì)胞的分化程度[16]。ALP 則廣泛分布在機(jī)體各個(gè)組織中，成骨細(xì)胞的增殖分化會(huì)分泌ALP。本研究結(jié)果顯示，NLRP3 炎癥小體抑制組大鼠血清OPG 與ALP 出現(xiàn)不同程度的升高，說明抑制NLRP3 炎癥小體可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，抑制破骨細(xì)胞活性。通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠牙槽骨缺損嚴(yán)重，且炎癥浸潤細(xì)胞較多，但NLRP3 炎癥小體抑制組牙槽骨缺損程度降低，并且炎癥浸潤細(xì)胞較少。并且與模型組比較，炎癥小體抑制組骨再生Lane-Sandhu 評(píng)分升高，提示該組骨形成程度較高。TARP 特異性地分布在破骨細(xì)胞中，因此TARP 染色是檢測(cè)骨組織中破骨細(xì)胞的常見方法，染色后破骨細(xì)胞呈紅色。本研究結(jié)果表明，相比模型組，炎癥小體抑制組破骨細(xì)胞數(shù)減少。既往研究顯示，激活NLRP3 炎癥小體活性后，關(guān)節(jié)組織中的破骨細(xì)胞數(shù)量上升[17]。

炎癥參與糖尿病病程，并且影響骨代謝過程。李石巖等[18]研究發(fā)現(xiàn)，抑制NLRP3 活性可以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。NOD樣受體（NOD-like receptor，NLRs）參與機(jī)體固有免疫，NLRP3 是NLRs 的主要成員之一，在糖尿病狀態(tài)下其表達(dá)上調(diào)。NLRP3 可以識(shí)別刺激信號(hào)并活化形成NLRP3 炎癥小體。NLRP炎癥小體會(huì)進(jìn)一步刺激下游Caspase-1，活化的Caspase-1 刺激pro-IL-1β，形成炎癥因子IL-1β。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，NLRP3 炎癥小體被抑制后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低。

因此，抑制NLRP3 炎癥小體可以抑制NLRP3/IL-1β 通路活化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，抑制破骨細(xì)胞活性，從而促進(jìn)糖尿病大鼠牙槽骨缺損的愈合。