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        NLR家族Pyrin域蛋白3炎癥小體對(duì)糖尿病大鼠牙槽骨缺損愈合的作用及其機(jī)制研究

        2022-12-17 08:07:54鄭毅趙彤
        關(guān)鍵詞:上頜骨牙槽骨骨細(xì)胞

        鄭毅,趙彤

        (1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 牙體牙髓科,天津 300070;2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔科,天津 300021)

        牙槽骨缺損是指上下頜骨邊緣鑲嵌牙根處因牙周炎、創(chuàng)傷或腫瘤等因素導(dǎo)致該處骨組織受損。牙槽骨受損嚴(yán)重時(shí),牙周組織支持力量減弱,牙齒松動(dòng)甚至脫落,因此牙槽骨缺損的修復(fù)對(duì)口腔疾病患者至關(guān)重要。臨床上無機(jī)材料、復(fù)合材料和自體牙骨移植材料常被用來修復(fù)牙槽骨缺損[1]。廖武堂[2]研究結(jié)構(gòu)顯示,Bio-Oss 骨粉結(jié)合豬小腸黏膜下層也可促進(jìn)牙槽骨組織的再生,有效修復(fù)牙槽骨缺損。但很多牙槽骨缺損患者同時(shí)合并糖尿病,在高糖環(huán)境下,骨代謝紊亂[3],牙槽骨缺損難以愈合,因此糖尿病患者的牙槽骨缺損修復(fù)是口腔科面臨的難點(diǎn)之一。目前,尚未有針對(duì)糖尿病患者牙槽骨缺損修復(fù)的有效方法。

        NLR家族Pyrin域蛋白3(NOD-like receptor 3,NLRP3)在糖尿病病程中扮演著重要角色。既往研究顯示,抑制NLRP3 炎癥小體可以加速糖尿病模型小鼠足部潰瘍傷口的愈合[4],但目前暫未見研究報(bào)道NLRP3 炎癥小體的活性與糖尿病大鼠牙槽骨缺損愈合的關(guān)系。因此本實(shí)驗(yàn)探究抑制NLRP3 炎癥小體糖尿病大鼠牙槽骨缺損愈合情況,以期為臨床尋找治療方案提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4 月齡健康SD 雄性大鼠30只,體重(220±20)g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(滬)2019-0003。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,正常飲食、飲水。

        1.1.2 主要試劑鏈脲佐菌素(上海源葉生物科技有限公司),NLRP3、Caspase-1、白細(xì)胞介素1β(Interleukin,IL-1β)、β-actin 兔抗大鼠一抗、HPR 標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗(美國(guó)Abcam 公司),護(hù)骨因子(osteoprotegerin,OPG)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)ELISA 試劑盒(上海瑞番生物科技有限公司),抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TARP)染色試劑盒(上海一研生物科技有限公司),Hifair?V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit試劑盒、Trieasy?Total RNA Extraction Reagent TRIeasy?總RNA 提取試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司),NLRP3 炎癥小體抑制劑(YQ128)、動(dòng)物組織蛋白抽提試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司),高糖飼料(上海銳賽生物技術(shù)有限公司)。

        1.1.3 主要儀器血糖儀BGM501(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司),多樣品組織研磨儀CEBO-24(上海測(cè)博生物科技發(fā)展中心),全自動(dòng)酶標(biāo)儀318C+(上海沛歐分析儀器有限公司),Qubit 熒光定量?jī)x、SimpliAmp PCR 儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司),80i 顯微鏡(日本Nikon 公司),一體式凝膠成像系統(tǒng)WD-9413D、轉(zhuǎn)印電泳儀DYCZ-40K(北京六一生物科技有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 糖尿病模型大鼠的復(fù)制高糖飼料飼養(yǎng)4 周后,大鼠腹腔注射0.1 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉稀釋的鏈脲佐菌素60 mg/kg。72 h 后用一次性測(cè)血糖針刺破大鼠尾尖取血(測(cè)量前12 h 禁食),用血糖儀檢測(cè)血糖,血糖≥16.7 mmol/L 為糖尿病模型復(fù)制成功[5]。

        將復(fù)制成功的糖尿病模型大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上,分離口腔上頜兩側(cè)第一磨牙腭側(cè)的牙齦與粘骨膜,用球鉆緩慢由近中向遠(yuǎn)中磨除部分牙槽骨骨質(zhì),形成大小約2.0 mm×2.0 mm×1.0mm 的缺口,磨除的同時(shí)注意用生理鹽水沖洗冷卻,縫合牙齦。

        <1),且各件產(chǎn)品是否為不合格品相互獨(dú)立.

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥將30 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組,每組10 只。模型復(fù)制成功后,炎癥小體抑制組大鼠立即尾靜脈注射20 mg/kg NLRP3 抑制劑(YQ128),1 次/d,連續(xù)給藥28 d。對(duì)照組和模型組大鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水,1 次/d,連續(xù)注射28 d。

        1.2.3 空腹血糖檢測(cè)給藥結(jié)束后大鼠禁食12 h,用一次性測(cè)血糖針刺大鼠尾部取血,血糖儀測(cè)量各組大鼠空腹血糖。

        1.2.4 骨代謝指標(biāo)檢測(cè)測(cè)量血糖后,大鼠尾靜脈采血,1 000 r/min 離心10 min,取上清液采用ELISA檢測(cè)OPG 和ALP 含量,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,用酶標(biāo)儀讀數(shù),將光密度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)孔位濃度。

        1.2.5 牙槽骨缺損區(qū)蘇木精-伊紅(hematoxylineosin,HE)染色及Lane-Sandhu 評(píng)分采血后,處死各組大鼠,取左側(cè)上頜骨復(fù)制缺損處的骨組織于多聚甲醛中固定24 h,然后置于100 g/L 乙二胺四乙酸溶液中脫鈣處理10周,每2 天換脫鈣液1 次。脫鈣后取出骨組織,常規(guī)脫水,石蠟包埋,蠟塊切片約4 μm厚,進(jìn)行HE 染色,顯微鏡下觀察牙槽骨愈合情況。根據(jù)Lane-Sandhu 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]評(píng)價(jià)再生情況,包括:①骨形成。無骨形成計(jì)0分,骨形成占骨缺損>0%~25%計(jì)1分,骨形成占骨缺損>25%~50%計(jì)2分,骨形成占骨缺損>50%~75%計(jì)3分,骨形成占骨缺損>75%~100%計(jì)4 分。②骨連接。骨折線清晰計(jì)0分,骨折線部分存在計(jì)1分,骨折線消失計(jì)2 分。③骨塑形。未見塑形計(jì)0分,髓腔形成計(jì)為2分,皮質(zhì)骨形成計(jì)4 分。

        1.2.6 TARP 染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)參照WU等[7]檢測(cè)方法,取1.2.5 中石蠟切片,加入蒸餾水水化脫蠟,采用TARP 染色試劑盒染色,蓋好蓋玻片,放入烘箱內(nèi)烘干,用顯微鏡觀察破骨細(xì)胞,每張切片隨機(jī)選取6 個(gè)視野進(jìn)行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)(不規(guī)則長(zhǎng)條形,胞漿呈紅色),計(jì)算平均值。

        1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA的表達(dá)取大鼠右側(cè)上頜骨復(fù)制缺損處的骨組織,剔除牙周軟組織后放入盛有液氮的研缽中,研磨成粉末,取100 mg粉末于離心管中,加入裂解液,室溫下裂解5 min后離心,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。取5 μL提取好的mRNA,按照試劑盒添加其余組分,加無菌無酶水補(bǔ)至30 μL,放入qRT-PCR 儀中。50℃、10min將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性15 s,60℃退火30s,共45 個(gè)循環(huán)。β-actin 作為內(nèi)參,根據(jù)Ct 值計(jì)算2-ΔΔCt。引物設(shè)計(jì)見表1。

        表1 qRT-PCR引物序列

        1.2.8 Western blotting 檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白的表達(dá)取1.2.7 中研磨好的骨組織粉末,在冰上加入蛋白提取試劑盒中的裂解液,于渦旋儀上混勻后離心,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度,SDS-PAGE 進(jìn)行凝膠電泳,電泳結(jié)束后,浸泡于轉(zhuǎn)膜液中將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 轉(zhuǎn)膜紙上,放入3%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h,加入一抗室溫下孵育過夜,洗膜,加入二抗孵育1 h,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光觀察,以β-actin 作為內(nèi)參計(jì)算灰度值。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.00 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,比較用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠空腹血糖的比較

        對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠空腹血糖分別為(5.27±1.08)mmol/L、(18.74±4.17)mmol/L 和(18.08±3.98)mmol/L,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.008,P=0.014),與對(duì)照組比較,模型組與炎癥小體抑制組空腹血糖均上升(P<0.05)。

        2.2 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較

        對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠OPG、ALP 比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.278和1.202,P=0.024 和0.316),模型組OPG、ALP 低于對(duì)照組和炎癥小體抑制組(P<0.05)。見表2。

        表2 各組大鼠OPG和ALP含量比較(n=10,)

        表2 各組大鼠OPG和ALP含量比較(n=10,)

        注:①與對(duì)照組比較,P <0.05;②與模型組比較,P <0.05。

        2.3 各組大鼠牙槽骨HE 染色及Lane-Sandhu 評(píng)分比較

        HE 染色結(jié)果顯示,模型組大鼠牙槽骨缺損嚴(yán)重,可見大量炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞,炎癥小體抑制組牙槽骨缺損程度低,炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞較少。見圖1。

        圖1 各組大鼠上頜骨組織(HE染色×400)

        對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠Lane-Sandhu 評(píng)分分別為(6.45±0.97)分、(3.98±0.61)分和(5.02±0.85)分,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.666,P=0.000),模型組Lane-Sandhu 評(píng)分低于對(duì)照組和炎癥小體抑制組(P<0.05)。

        2.4 各組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)比較

        TARP 染色結(jié)果顯示,對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)分別為(1.01±0.03)個(gè)/HP、(11.24±2.21)個(gè)/HP 和(8.01±1.68)個(gè)/HP,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=106.447,P=0.000),模型組破骨細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組和炎癥小體抑制組(P<0.05)。見圖2。

        圖2 各組大鼠上頜骨組織(TARP染色×200)

        2.5 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

        對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.175、18.414 和23.672,P=0.001、0.000 和0.000),模型組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和炎癥小體抑制組(P<0.05)。見表3。

        表3 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(n=10,)

        表3 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(n=10,)

        注:①與對(duì)照組比較,P <0.05;②與模型組比較,P <0.05。

        2.6 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

        對(duì)照組、模型組、炎癥小體抑制組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.121、12.333 和10.932,P=0.001、0.000 和0.002),模型組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和炎癥小體抑制組(P<0.05)。見表4和圖3。

        表4 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(n=10,)

        表4 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(n=10,)

        注:①與對(duì)照組比較,P <0.05;②與模型組比較,P <0.05。

        圖3 各組大鼠上頜骨組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達(dá)

        3 討論

        牙槽骨位于上下頜骨邊緣處鑲嵌牙齦的位置,是上下頜骨的牙槽突出部分。一般情況下,隨著年齡的增長(zhǎng)及牙齒的不斷咀嚼擠壓會(huì)導(dǎo)致牙槽骨不斷吸收,高度下降;另外,在牙周炎等一些病理或外力的作用下,也會(huì)導(dǎo)致牙槽骨的缺損[8]。納米羥基磷灰石、類骨質(zhì)羥磷灰石等材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人工修復(fù)牙槽骨缺損中[9]。但臨床治療中發(fā)現(xiàn),牙槽骨缺損糖尿病患者接受治療后,高血糖導(dǎo)致骨愈合緩慢甚至出現(xiàn)不愈合,造成人工修復(fù)失敗,患者面臨失牙風(fēng)險(xiǎn)。有研究顯示,炎癥因子在糖尿病大鼠骨折愈合中發(fā)揮重要作用[10],NLRP3 炎癥小體是各種炎癥反應(yīng)的重要部分[11],因此探究抑制NLRP3 炎癥小體對(duì)糖尿病大鼠牙槽骨缺損愈合的影響具有重要的臨床意義。

        牙槽骨缺損愈合過程也就是局部骨重建的過程,即破骨細(xì)胞釋放酸液溶解舊骨,成骨細(xì)胞分泌骨膠原形成新骨,兩種作用保持動(dòng)態(tài)的平衡[12],但糖尿病會(huì)引起患者機(jī)體骨代謝紊亂[13],破骨細(xì)胞被激活,成骨細(xì)胞受到抑制,導(dǎo)致骨愈合受阻,牙槽骨缺損難以愈合。OPG 和ALP 是典型的骨形成標(biāo)志[14-15],OPG 又被稱為破骨細(xì)胞分化因子。有研究顯示,抑制OPG 的活性會(huì)降低破骨細(xì)胞的分化程度[16]。ALP 則廣泛分布在機(jī)體各個(gè)組織中,成骨細(xì)胞的增殖分化會(huì)分泌ALP。本研究結(jié)果顯示,NLRP3 炎癥小體抑制組大鼠血清OPG 與ALP 出現(xiàn)不同程度的升高,說明抑制NLRP3 炎癥小體可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化,抑制破骨細(xì)胞活性。通過HE 染色發(fā)現(xiàn),模型組大鼠牙槽骨缺損嚴(yán)重,且炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞較多,但NLRP3 炎癥小體抑制組牙槽骨缺損程度降低,并且炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞較少。并且與模型組比較,炎癥小體抑制組骨再生Lane-Sandhu 評(píng)分升高,提示該組骨形成程度較高。TARP 特異性地分布在破骨細(xì)胞中,因此TARP 染色是檢測(cè)骨組織中破骨細(xì)胞的常見方法,染色后破骨細(xì)胞呈紅色。本研究結(jié)果表明,相比模型組,炎癥小體抑制組破骨細(xì)胞數(shù)減少。既往研究顯示,激活NLRP3 炎癥小體活性后,關(guān)節(jié)組織中的破骨細(xì)胞數(shù)量上升[17]。

        炎癥參與糖尿病病程,并且影響骨代謝過程。李石巖等[18]研究發(fā)現(xiàn),抑制NLRP3 活性可以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。NOD樣受體(NOD-like receptor,NLRs)參與機(jī)體固有免疫,NLRP3 是NLRs 的主要成員之一,在糖尿病狀態(tài)下其表達(dá)上調(diào)。NLRP3 可以識(shí)別刺激信號(hào)并活化形成NLRP3 炎癥小體。NLRP炎癥小體會(huì)進(jìn)一步刺激下游Caspase-1,活化的Caspase-1 刺激pro-IL-1β,形成炎癥因子IL-1β。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,NLRP3 炎癥小體被抑制后,NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低。

        因此,抑制NLRP3 炎癥小體可以抑制NLRP3/IL-1β 通路活化,促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化,抑制破骨細(xì)胞活性,從而促進(jìn)糖尿病大鼠牙槽骨缺損的愈合。

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