朱江，郭森，竇志杰，張弛

（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000）

腦卒中又稱腦血管意外，是一種常見的急性腦血管疾病，一般分為缺血性卒中和出血性卒中，具有較高的發(fā)病率、病死率和致殘率[1]。近年來腦卒中發(fā)病率呈上升趨勢，且逐漸年輕化[2]。臨床上以溶栓和機械取栓為腦卒中的主要治療手段，取栓后雖然能恢復腦組織血液灌注，但是缺血造成的腦神經(jīng)損傷卻無法修復，因此多數(shù)患者預后不良，伴有不同程度的身體殘疾[3]。既往研究結(jié)果顯示，在及時有效的治療下，中樞神經(jīng)元可以再生，腦組織損傷或可逆[4]。鹽酸納美芬是阿片受體拮抗劑，具有抗休克、腦保護和治療脊髓損傷等作用。既往研究結(jié)果顯示，鹽酸納美芬可以減少七氟烷麻醉大鼠神經(jīng)元凋亡，提高認知能力[5]。目前關(guān)于鹽酸納美芬對大腦中動脈缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）神經(jīng)保護作用的報道很少，因此本研究采用鹽酸納美芬預注射，探究其對大腦中動脈缺血再灌注大鼠模型的神經(jīng)保護作用，以期為臨床治療腦卒中提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠36只，體重（220±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2021-004。適應性飼養(yǎng)1周，正常飼養(yǎng)供水。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑鹽酸納美芬注射液（1 mg/mL，國藥準字H20080652，遼寧海思科制藥有限公司），大鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（批 號：ml077379）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）ELISA 試劑盒（批 號：ml077384）（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1091，上海碧云天生物科技有限公司），腦組織蛋白提取試劑盒（批號：ml077391，上海酶聯(lián)生物科技有限公司），Caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH 兔抗大鼠一抗、羊抗兔HRP 標記二抗（美國Abcam 公司）。

1.2.2 主要儀器光學顯微鏡（日本Olympus 公司），酶標分析儀（美國Thermo 公司），Sigma 3-18K臺式速冷凍離心機（德國Sigma 公司），Tissuelyser Ⅱ高通量組織研磨儀（德國Qiagen 公司），Gel Doc 凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 MCAO/R 模型的復制采用線栓法復制MCAO/R）模型[6]，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，側(cè)臥固定于手術(shù)臺上，在頸部右側(cè)做長約2 cm 切口，鈍性分離頸總動脈（common carotid artery,CCA）與鄰近肌肉和神經(jīng)，暴露頸外動脈（external carotid artery,ECA）、頸內(nèi)動脈（internal carotid artery,ICA），結(jié)扎CCA、ECA，動脈夾夾緊ICA，用眼科剪在ECA 與ICA 分叉處做1 mm 切口，置入外科手術(shù)尼龍線并輕輕向內(nèi)推進，直至遇到明顯阻力，則表明尼龍線已經(jīng)到達大腦中動脈起始端，固定尼龍線。缺血2 h后，緩慢抽出尼龍線約10 min 形成缺血再灌注損傷，逐層縫合切口。整個過程中大鼠置于37℃恒溫箱中保持體溫。

1.3.2 實驗分組與給藥將36 只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、鹽酸納美芬組，各12 只。鹽酸納美芬組大鼠復制MCAO/R 模型前10 min 尾靜脈注射20 μg/kg 鹽酸納美芬注射液，假手術(shù)組和模型組注射等體積生理鹽水。隨后除假手術(shù)組（不進行CCA、ECA 結(jié)扎）外，其余兩組采用線栓法復制MCAO/R 模型。

1.3.3 神經(jīng)功能評分MCAO/R 模型復制完成后，放回鼠籠恢復24 h，參照Longa 評分標準進行大鼠神經(jīng)功能評分[7]：正常（無神經(jīng)損傷癥狀）計0 分；輕度（提尾時左前爪不張）計1 分；中度（行走時向左盤旋）計2 分；重度（行走困難，向左傾斜）計3 分；極嚴重（不能自發(fā)行走）計4 分。

1.3.4 ELISA檢測腦組織SOD活性、MDA含量神經(jīng)功能評分后，每組隨機選取4 只大鼠，立即處死后取頭，迅速于冰上解剖分離大鼠右側(cè)腦組織，加入適量生理鹽水，4℃勻漿腦組織，3 000 r/min離心10 min，取上清液，參照試劑盒說明書加入待測樣本，最后在450 nm 波長下讀取各孔光密度（optical density,OD）值，根據(jù)OD 值計算SOD 活性、MDA 含量。

1.3.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色觀察腦組織病理變化每組隨機選取4 只大鼠，腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉麻醉，開胸行主動脈插管，用200 mL 生理鹽水快速沖洗，隨后灌入4%多聚甲醛400 mL 固定，常規(guī)石蠟包埋，切片機切腦組織厚約5 μm。取切片烤干，加二甲苯脫蠟，重復1次，加乙醇脫苯，重復1次，洗凈乙醇后常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

1.3.6 TUNEL染色觀察細胞凋亡取1.3.5 中腦組織切片，加入二甲苯脫蠟10 min，重復1 次。加入無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水沖干凈。滴加不含DNase 的蛋白酶K 20 μg/mL，37℃、20 min。PBS 洗滌3次，除去蛋白酶K。加入內(nèi)源性過氧化物酶強力封閉液，室溫下孵育20 min，滅活切片中的內(nèi)源過氧化物酶，PBS 洗滌3 次。參照TUNEL 試劑盒說明書，配制生物素標記液，現(xiàn)用現(xiàn)配。切片上滴加50 μL 生物素標記液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗滌1次，再滴加0.2 mL 標記反應終止液，室溫下孵育10 min。參照試劑盒說明書配制Streptavidin-HRP 工作液 和DAB 顯色液。PBS 洗滌3次，滴加50 μL Streptavidin-HRP 工作液，室溫孵育30 min，滴加0.3 mL DAB顯色液，室溫孵育20 min[8]。PBS 洗滌3次，在顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，隨機選取5 個視野，計算每個視野中凋亡細胞數(shù)并記錄平均值（視野中棕色為陽性凋亡細胞）。

1.3.7 Western blotting 檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白的表達各組隨機選取4 只大鼠，處死后取頭，于冰上解剖分離右側(cè)腦組織，加入組織蛋白提取液，組織勻漿器勻漿，4℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清液，采用BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白20 μg，通過SDS-PAGE 分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5%脫脂牛奶封閉后，將PVDF 膜與Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗體在4℃孵育過夜。緩沖液洗膜3次，PVDF 膜與二抗孵育1 h，洗膜3次，顯色液顯色。采用ImageJ軟件定量分析蛋白相對表達量，以GAPDH 為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，比較用方差分析或t檢驗，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠神經(jīng)功能損傷情況

假手術(shù)組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠神經(jīng)功能評分分別為（0.00±0.00）分、（3.14±0.58）分和（2.21±0.41）分。假手術(shù)組分別與模型組、鹽酸納美芬組大鼠神經(jīng)功能評分比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=18.754和18.672，均P=0.000），假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分較低。模型組與鹽酸納美芬組大鼠神經(jīng)功能評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.536，P=0.000），鹽酸納美芬組大鼠神經(jīng)功能評分低于模型組。

2.2 3組大鼠腦組織SOD活性、MDA含量比較

假手術(shù)組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠腦組織SOD 活性、MDA 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.211 和15.625，均P=0.000）。進一步兩兩比較結(jié)果：模型組、鹽酸納美芬組SOD 活性低于假手術(shù)組（P＜0.05），MDA 含量高于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組相比，鹽酸納美芬組SOD 活性升高（P＜0.05），MDA 含量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠腦組織SOD活性、MDA含量比較（n=4，）

表1 3組大鼠腦組織SOD活性、MDA含量比較（n=4，）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

2.3 3組大鼠腦組織病理變化

假手術(shù)組細胞輪廓清晰，排列有序。模型組細胞破損，數(shù)量減少，炎癥浸潤嚴重。鹽酸納美芬組細胞數(shù)量較多，輪廓清晰，炎癥浸潤減少（見圖1）。

圖1 3組大鼠腦組織病理變化（HE染色×400）

2.4 3組大鼠腦組織凋亡細胞數(shù)比較

假手術(shù)組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠凋亡細胞數(shù)分別為（4.12±1.07）個/HP、（52.87±10.54）個/HP和（30.76±8.57）個/HP，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=38.508，P=0.000）。進一步兩兩比較結(jié)果：模型組、鹽酸納美芬組凋亡細胞數(shù)多于假手術(shù)組（P＜0.05）；鹽酸納美芬組凋亡細胞數(shù)少于模型組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3組大鼠腦組織細胞凋亡情況（TUNEL染色×200）

2.5 3 組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量比較

假手術(shù)組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=29.871、33.992 和14.459，均P=0.000）。進一步兩兩比較結(jié)果：模型組、鹽酸納美芬組Caspase-3、Bax 蛋白相對表達量高于假手術(shù)組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相對表達量低于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組相比，鹽酸納美芬組Caspase-3、Bax 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見 表2和圖3。

表2 3組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（n=4，）

表2 3組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（n=4，）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

圖3 3組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達

3 討論

缺血性腦卒中是腦血管堵塞引起的腦損傷疾病，發(fā)病原因為大腦中動脈出現(xiàn)梗死，中斷腦組織供血。即使在短時間內(nèi)恢復供血，腦組織也會受到不同程度的損傷，使腦神經(jīng)功能受損[9]。目前臨床上常采用組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator,t-PA）進行血栓溶解[10]，但t-PA有效時間窗口狹窄（4.5 h 內(nèi)），并且恢復血液灌注后，受損的腦組織神經(jīng)元難以修復，因此尋找具有神經(jīng)保護作用的藥物對治療腦組織缺血再灌注導致的神經(jīng)損傷具有重要意義。鹽酸納美芬與其他阿片受體拮抗劑一樣，具有抗昏迷、抗休克等作用。鹽酸納美芬可以透過血腦屏障，注射后可以迅速到達腦組織，促進損傷神經(jīng)的修復，具有修復受損神經(jīng)元的作用[11]。既往研究結(jié)果顯示，臨床上治療急性腦梗死時，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用鹽酸納美芬可以提高療效[12]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)行走困難，并向左傾斜的癥狀，說明右側(cè)腦組織損傷嚴重；鹽酸納美芬組大鼠行走時雖向左盤旋，但行走障礙不明顯，說明右腦神經(jīng)功能得到部分修復。腦組織缺血再灌注過程會產(chǎn)生大量的氧自由基，導致脂質(zhì)過氧化，破壞細胞膜，損傷神經(jīng)元[13]。MDA 是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物[14]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠MDA 含量升高，說明MCAO/R后，大鼠腦組織中脂質(zhì)過氧化反應水平升高，腦組織氧化損傷嚴重。與模型組相比，預注射鹽酸納美芬后大鼠腦組織MDA 含量降低。SOD 參與氧自由基的清除，對抗機體氧化應激反應[15]。本研究中，與模型組相比，預注射鹽酸納美芬的大鼠腦組織SOD 活性升高，說明腦組織抗氧化水平提高。通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，MCAO/R 對腦組織造成損害，細胞破損嚴重，炎癥浸潤增加，而預注射鹽酸納美芬后，大鼠腦組織炎癥浸潤減少，細胞數(shù)量增多，提示鹽酸納美芬具有一定腦組織保護作用。

腦組織缺血時，神經(jīng)元會激活小膠質(zhì)細胞，釋放活性氧（reactive oxygen species,ROS）。ROS 刺激線粒體釋放細胞色素C（cytochrome C,Cyt-C），與凋亡蛋白酶激活因子形成聚合物，激活細胞凋亡終末蛋白Caspase-3，促進凋亡的發(fā)生。Bcl-2 是細胞中重要的抗凋亡基因，其通過抑制細胞中蓄積的Cyt-C和Caspase-3，達到抑制細胞凋亡的作用。Bax屬于Bcl-2基因家族，過表達拮抗Bcl-2 形成二聚體，抑制Bcl-2 的保護作用[16-17]。本研究中，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織Caspase-3、Bax 蛋白相對表達量升高，Bcl-2 蛋白相對表達量降低，說明MCAO/R時腦組織發(fā)生氧化應激反應，造成腦組織損傷，大量細胞凋亡。當預注射鹽酸納美芬后，與模型組相比，鹽酸納美芬組大鼠腦組織Caspase-3、Bax 蛋白相對表達量降低，Bcl-2 蛋白相對表達量升高，提示鹽酸納美芬可以抑制氧化應激發(fā)生，具有神經(jīng)保護作用；并且通過TUNEL 染色觀察到，相比模型組，鹽酸納美芬組大鼠腦組織凋亡細胞減少。

綜上所述，鹽酸納美芬具有抗氧化應激作用，可抑制細胞凋亡，保護腦神經(jīng)。其作用機制與調(diào)控Caspase-3/Bcl-1/Bax 通路有關(guān)，但具體調(diào)控機制有待進一步研究證實。