衡昭君，馬 洲，董星和，程文杰，鄒豐才，黃翠琴，賀君君，楊建發(fā)

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.保山市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 云南 保山 678000；3.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 364000)

隱孢子蟲 (Cryptosporidiumspp.) 是重要的人獸共患原蟲之一，其宿主范圍廣泛，可感染包括人在內(nèi)的260 種脊椎動(dòng)物[1]。人類感染隱孢子蟲后，主要癥狀為腹瀉，目前已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)列為人類最常見的6 種腹瀉病之一[2]，同時(shí)也是繼輪狀病毒后引起兒童嚴(yán)重腹瀉的第二大病原體[3]。隱孢子蟲屬已報(bào)道有40 多個(gè)種和70 多種基因型[4-5]，其中人可感染的隱孢子蟲蟲種有微小隱孢子蟲 (C.parvum)、人隱孢子蟲 (C.hominis)、鼠隱孢子蟲(C.muris)、安氏隱孢子蟲 (C.andersoni)、貓隱孢子蟲 (C.felis)、犬隱孢子蟲 (C.canis)、火雞隱孢子蟲 (C.meleagridis) 和豬隱孢子蟲 (C.suis) 等[6]，且多為在野生動(dòng)物上鑒定出的人獸共患隱孢子蟲[7]。隱孢子蟲主要通過受污染的水源和食物等途徑傳播[8]，已在全球范圍內(nèi)引發(fā)多起食源性和水源性隱孢子蟲病的暴發(fā)[9-11]。

在國(guó)內(nèi)，王利勤等[12]對(duì)成都動(dòng)物園圈養(yǎng)野生動(dòng)物隱孢子蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲總感染率為4.19%；宋源等[7]對(duì)貴陽動(dòng)物園圈養(yǎng)野生動(dòng)物隱孢子蟲的感染流行情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果從該園野生動(dòng)物體內(nèi)鑒定出安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、人隱孢子蟲和鼠隱孢子蟲等4 種隱孢子蟲，均為人獸共患隱孢子蟲蟲種，該園隱孢子蟲總體感染率達(dá)15.50%。可見，對(duì)動(dòng)物園野生動(dòng)物進(jìn)行隱孢子蟲檢測(cè)具有重要的公共衛(wèi)生意義。前期國(guó)內(nèi)對(duì)于野生動(dòng)物寄生蟲的研究多基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，通過顯微鏡觀察形態(tài)對(duì)分離到的蟲株進(jìn)行鑒定，隨著野生動(dòng)物對(duì)寄生蟲的感染和傳播問題的加重，中國(guó)開始注重對(duì)動(dòng)物園野生動(dòng)物腸道原蟲進(jìn)行檢測(cè)，但目前仍缺乏有關(guān)袋鼠源隱孢子蟲所屬的基因型背景資料。本研究通過巢氏PCR 技術(shù)擴(kuò)增對(duì)云南某動(dòng)物園袋鼠源隱孢子蟲分離株的18S rRNA 基因序列進(jìn)行分析，通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)該隱孢子蟲分離株的種類進(jìn)行鑒定，以期為深入研究袋鼠源隱孢子蟲提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟲株

對(duì)云南某動(dòng)物園進(jìn)行寄生蟲感染調(diào)查時(shí)，從袋鼠糞樣中獲得蟲株樣品，將其保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 糞樣處理

取適量樣品于燒杯中，加入清水?dāng)嚢杈鶆颍?0 目銅篩過濾于50 mL 離心管中；用高速臺(tái)式離心機(jī) (Model CF-10，Wise Spin 公司生產(chǎn)) 以3 000 r/min 離心3 min，棄去上清液，保留沉淀并將其振蕩混勻；吸取沉淀250 μL 于2 mL 離心管中，按照OMEGA 糞樣DNA 提取試劑盒 (EZNAR stool DNA Kit 試劑盒，USA 生產(chǎn)) 說明書進(jìn)行DNA 提取，將獲得的DNA 置于4 ℃保存，備用。

1.3 PCR 擴(kuò)增

基于小核糖體核苷酸 (18S rRNA) 基因進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增，引物序列按照XIAO 等[13]設(shè)計(jì)的引物合成。第1 輪引物：上游5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′，下游5′-CCCTAATCCTTCGAAACAGGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為1 325 bp；第2 輪 引 物：上 游5′-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3′，下游5′-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段約為830 bp。反應(yīng)體系包括：dNTP 2.00 μL，MgCl22.00 μL，10×PCR Buffer (Mg2+free) 2.50 μL，r-TaqDNA 聚合酶0.25 μL，上、下游引物各0.25 μL，DNA 模板2.00 μL，最后添加滅菌雙蒸水至25.00 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；第2 輪反應(yīng)退火溫度為58 ℃。

1.4 PCR 產(chǎn)物鑒定和測(cè)序

將第2 輪PCR 產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并鑒定，電泳完成后取凝膠放置在紫外凝膠成像分析儀 (WGD-30，BAYGENE 公司生產(chǎn))中觀察，若結(jié)果出現(xiàn)目的片段大小則將該P(yáng)CR 產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將本研究獲得的基因序列在GenBank 上進(jìn)行BLAST 搜索，下載不同種隱孢子蟲分離株的基因序列，使用DNAMAN 和MEGA 7.0 等軟件將本研究獲得的序列與其他種隱孢子蟲進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；用MEGA 7.0 軟件、以鄰接法 (neighbor-joining，NJ) 中的Kimura-2-parameter 模型自展值檢驗(yàn) (Bootstrap test) 估計(jì)所構(gòu)建基因樹的可靠性，并用1 000 個(gè)重復(fù)。本研究中，節(jié)點(diǎn)支持值低于50%的進(jìn)行隱藏，支持值大于95%的則認(rèn)為Bootstrap 分析顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

隱孢子蟲18S rRNA 基因引物成功擴(kuò)增出袋鼠源隱孢子蟲陽性目的條帶，長(zhǎng)約823 bp，與預(yù)期大小一致(圖1)。

圖1 袋鼠源隱孢子蟲18S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)Fig.1 Detection of Cryptosporidium 18S rRNA PCR amplification products

2.2 袋鼠源隱孢子蟲分離株18S rRNA 基因序列的同源性分析

由圖2 可知：在18S rRNA 基因位點(diǎn)，袋鼠源隱孢子分離株KMK1 與已報(bào)道的中國(guó)猴源鼠隱孢子蟲 (登錄號(hào)：GU319782)、華盛頓駱駝源鼠隱孢子蟲 (登錄號(hào)：AF093497) 和日本褐家鼠鼠隱孢子蟲 (登錄號(hào)：AB089284) 無堿基差異，序列相似度為100%，且該袋鼠源隱孢子蟲與鼠隱孢子蟲的序列同源性最高。

圖2 基于18S rRNA 基因的袋鼠源隱孢子蟲分離株（KMK1）與其他源隱孢子蟲同源性比較Fig.2 Homology comparison of Cryptosporidium kangaroo isolate (KMK1) based on 18S rRNA gene with other Cryptosporidium sources

2.3 基于18S rRNA 基因序列的種系發(fā)育分析

由圖3 可知：種系發(fā)育樹形成2 個(gè)主要大分支，上半部分支為腸道寄生的隱孢子蟲，包括維瑞隱孢子蟲、人隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、火雞隱孢子蟲、豬隱孢子蟲、犬隱孢子蟲、貓隱孢子蟲、牛隱孢子蟲、芮氏隱孢子蟲和鹿隱孢子蟲基因型 ；另一分支則是胃寄生隱孢子蟲，包括龜隱孢子蟲、蛇隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、鼠隱孢子蟲和本研究分離得到的袋鼠源隱孢子蟲分離株KMK1。KMK1 與鼠隱孢子蟲處于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近，節(jié)點(diǎn)支持值顯著 (96%)，屬于胃寄生隱孢子蟲中的鼠隱孢子蟲。

圖3 基于鄰接法構(gòu)建的隱孢子蟲18S rRNA 基因核苷酸序列種系發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Evolutionary relationships among Cryptosporidium inferred by neighbor-joining analysis of 18S rRNA nucleotide sequences

3 討論

隱孢子蟲主要寄生于人或其他動(dòng)物胃腸道和呼吸道上皮細(xì)胞中，感染后能引起人獸共患隱孢子蟲病。1907 年TYZZER[14]首次從試驗(yàn)小鼠體內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)該蟲，至今包括禽類、哺乳類、爬行類和兩棲類等幾乎所有脊椎動(dòng)物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有隱孢子蟲感染。目前，隱孢子蟲屬已報(bào)道40 多個(gè)種和70 多種基因型[4-5]，且已經(jīng)在人類中檢測(cè)到至少20 個(gè)種和5 種基因型[15-16]。隱孢子蟲種類繁多，卵囊較小，不同蟲種之間形態(tài)相似，傳統(tǒng)的顯微鏡觀察法難以通過形態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的學(xué)者開始使用分子生物學(xué)方法鑒定隱孢子蟲蟲種。目前用于隱孢子蟲分類的基因主要有核糖體小亞基RNA(18S rRNA)、卵囊壁蛋白 (COWP)、70 ku 熱休克蛋白 (HSP70) 和肌動(dòng)蛋白 (Actin) 等基因位點(diǎn)[17]。其中，18S rRNA 基因位點(diǎn)具有多拷貝特性，存在可用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的保守區(qū)和區(qū)別物種的多態(tài)性區(qū)域，能夠設(shè)計(jì)特異性引物，已被廣泛應(yīng)用于人、其他動(dòng)物和水源性隱孢子蟲的蟲種鑒定和基因分型研究[18]。本研究依據(jù)XIAO等[13]報(bào)道的隱孢子蟲18S rRNA 基因引物對(duì)袋鼠源隱孢子蟲陽性樣品DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)約823 bp 的目的片段，測(cè)序獲得的袋鼠源隱孢子蟲基因序列經(jīng)BLAST 在線比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其與鼠隱孢子蟲(C.muris，GU319782、AF093497 和AB089284) 無差異堿基，同源性高達(dá)到100%。同時(shí)，從種系發(fā)育進(jìn)化樹中也可以看出，本研究的分離株和鼠隱孢子蟲親緣關(guān)系最近，處于同一進(jìn)化分支。綜上所述，該袋鼠源隱孢子蟲分離株鑒定為鼠隱孢子蟲(C.muris)。

研究表明：野生動(dòng)物在將疾病向人類傳播的過程中扮演了重要角色[19-20]，而動(dòng)物園中的野生動(dòng)物因其與人類接觸更頻繁，所以將傳染病如寄生蟲等傳播給人類的可能性更大[21]，因此，研究野生動(dòng)物和動(dòng)物園圈養(yǎng)動(dòng)物體內(nèi)的人獸共患寄生蟲具有重要的公共衛(wèi)生意義。目前，隱孢子蟲在野生動(dòng)物中的發(fā)現(xiàn)和報(bào)道越來越多，已成為常見寄生蟲種之一。據(jù)MICHELLE[22]統(tǒng)計(jì)：袋鼠可以感染多種隱孢子蟲，隱孢子蟲卵囊已經(jīng)在16 種有袋動(dòng)物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，主要檢測(cè)出費(fèi)氏隱孢子蟲(C.fayeri)、袋鼠隱孢子蟲 (C.macropodum)、鼠隱孢子蟲 (C.muris)以及負(fù)鼠隱孢子蟲基因型(Opossum genotypes I、Opossum genotypes II、Brushtail possum genotypes I 和Brushtail possum genotypes II)，其中費(fèi)氏隱孢子蟲和鼠隱孢子蟲具有人獸共患性，可廣泛存在于家養(yǎng)動(dòng)物和野生動(dòng)物中[19]。鼠隱孢子蟲可感染人、鼠、巖貍、雙峰駝、野生白山羊、犬、貓、狗、猴和豬等多種哺乳動(dòng)物。在中國(guó)，已有很多對(duì)動(dòng)物園野生動(dòng)物寄生蟲的調(diào)查，但多基于常規(guī)的顯微鏡檢測(cè)，且對(duì)于袋鼠相關(guān)疾病的研究較少，尚未有袋鼠感染鼠隱孢子蟲的報(bào)道。本研究通過PCR 方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：云南某動(dòng)物園中一袋鼠源隱孢子蟲蟲種為鼠隱孢子蟲，不僅提示了袋鼠具有傳播人獸共患隱孢子蟲的潛在風(fēng)險(xiǎn)，也豐富了中國(guó)袋鼠可感染隱孢子蟲種類，為中國(guó)袋鼠源隱孢子蟲流行病學(xué)研究提供了基礎(chǔ)資料。在今后的研究中可進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)樣本的數(shù)量和地區(qū)，以進(jìn)一步確定袋鼠源隱孢子蟲的感染情況、種系發(fā)育和人獸共患風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

本研究從云南某動(dòng)物園袋鼠中分離到的1 株隱孢子蟲分離株KMK1 與先前報(bào)道的鼠隱孢子蟲(C.muris) 同源性達(dá) 100%，且在種系發(fā)育進(jìn)化樹中也與鼠隱孢子蟲處于同一小分支，Bootstrap 分析顯著，表明該袋鼠源隱孢子蟲分離株為鼠隱孢子蟲。鼠隱孢子蟲屬于人獸共患寄生蟲，說明云南地區(qū)袋鼠具有潛在傳播人獸共患隱孢子蟲的風(fēng)險(xiǎn)。