王益娜，陳碧環(huán)，郭兆寬，劉祥宇，張廣輝，楊生超

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

1996 年，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S288C 菌株)的基因組成為第1 個(gè)完全測序的真核基因組，對基因組組織和進(jìn)化等具有重要意義[1]。作為一種廣為人知的傳統(tǒng)模式酵母，釀酒酵母具有產(chǎn)物安全性、豐富的基因編輯工具且容易操作，在工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用；與細(xì)菌、其他酵母和絲狀真菌相比，釀酒酵母對寬pH 范圍、高濃度乙醇、糖以及高滲透壓的耐受性使其成為與工業(yè)乙醇相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)的首選宿主[2-4]。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一種二態(tài)、非致病的非常規(guī)產(chǎn)油酵母[5]，因其高分泌能力、強(qiáng)大的乙酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 通量[6-8]、大量的遺傳工具[9-10]以及安全性[11]而受到全世界的關(guān)注。解脂耶氏酵母能在正構(gòu)烷烴上生長并產(chǎn)生高水平的有機(jī)酸(如檸檬酸)以及大量異源蛋白質(zhì)和代謝物[12-13]，被廣泛用于重組蛋白、赤蘚糖醇、檸檬酸和脂類等工業(yè)生產(chǎn)[14-15]。該酵母只能使用有限范圍的C6 糖(如葡萄糖、果糖和甘露糖)[16]，但它可以利用醋酸酯、醇和疏水底物(包括油、烷烴和脂肪酸)；作為專性需氧菌，該酵母對氧氣濃度非常敏感，是影響其生命周期生長和代謝的重要因素；其適宜的生長溫度應(yīng)低于32～34 ℃[17]，與釀酒酵母相比，解脂耶氏酵母是一種Crabtree陰性酵母，不會(huì)產(chǎn)生乙醇，適合高密度發(fā)酵[18]。

芳香族化合物及其衍生物廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化妝品、聚合物、營養(yǎng)品和制藥等行業(yè)，其主要來源是石油資源。石油資源的過度開發(fā)及消費(fèi)導(dǎo)致三大能源日益枯竭，污染日益嚴(yán)重[19]。人們通過構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠作為石油資源的替代來源，利用大腸桿菌和酵母等模式生物，以廉價(jià)的碳源或前體為底物生產(chǎn)芳香族化合物及其衍生物[20]。對香豆酸、對羥基苯丙酸、阿魏酸、咖啡酸和肉桂酸是許多具有商業(yè)價(jià)值的化學(xué)品的前體，其生物合成途徑是生產(chǎn)芳香族化合物的核心代謝途徑之一，同時(shí)也是生物合成多種天然產(chǎn)物(如黃酮類和生物堿)的主要底物[21]。然而，關(guān)于工程菌對不同酚酸類小分子物質(zhì)的耐受性研究仍不夠全面，目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道釀酒酵母和解脂耶氏酵母對酚酸類小分子物質(zhì)的耐受性。本研究系統(tǒng)比較了釀酒酵母和解脂耶氏酵母對對羥基苯丙酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和肉桂酸的耐受性，以期為芳香族化合物及其衍生物的合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株包括釀酒酵母W303 和解脂耶氏酵母W29，均由中國科學(xué)院天津生物工業(yè)研究所保存。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

酵母提取物(OXOID 公司)，蛋白胨(OXOID公司)，對羥基苯丙酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和肉桂酸樣品(純度大于98%，上海源葉生物科技有限公司)，DMSO (北京索萊寶科技有限公司)；實(shí)時(shí)微生物生長曲線分析儀[杰靈儀器制造(天津)有限公司]，高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ602 型)，恒溫培養(yǎng)搖床(北京億諾生物科技有限公司)，電子天平(上海梅特勒-托利多公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 YPD 液體培養(yǎng)基的制備

稱量葡萄糖20 g、蛋白胨20 g 和酵母提取物10 g，溶于水中并定容至1 L，115 ℃滅菌20 min后制得。

1.3.2 種子液制備

將-80 ℃保存的甘油菌劃線于固體YPD 平板中活化菌種，從平板中挑1 個(gè)單克隆接種于含有3 mL YPD 液體培養(yǎng)基的15 mL 試管中，于30 ℃、220 r/min 搖菌48 h 得到種子液。

1.3.3 不同濃度酚酸樣品的配制

對羥基苯丙酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和肉桂酸底物配制初始濃度為2 mol/L 的母液，分別溶于DMSO 溶液后再稀釋為1 mol/L 以及500、400、300、200、100 和50 mmol/L 等不同濃度。

1.3.4 釀酒酵母和解脂耶氏酵母細(xì)胞生長曲線的測定

用移液槍取1.3.2 節(jié)制備的種子液20 μL，將其加入含有YPD 液體培養(yǎng)基480 μL 的48 孔板中，每個(gè)樣品3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)；將孔板置于實(shí)時(shí)微生物生長曲線分析儀中，溫度設(shè)置為30 ℃，每2 h 測定1 次OD600值，連續(xù)測定24 h。測定完成后記錄數(shù)據(jù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖。

1.3.5 釀酒酵母和解脂耶氏酵母對不同酚酸耐受性的測定

在48 孔板中加入YPD 液體培養(yǎng)基477.5 μL，并分別接種釀酒酵母和解脂耶氏酵母種子液20 μL，再分別加入不同濃度的酚酸樣品2.5 μL，使酚酸的終濃度為5.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.50 和0.25 mmol/L，每個(gè)樣品3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。設(shè)置2 組空白對照組，一組加入DMSO 溶液2.5 μL，另一組加入無菌水2.5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母和解脂耶氏酵母的生長曲線

由圖1 可知：解脂耶氏酵母培養(yǎng)6 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期，18 h 后趨于平穩(wěn)；釀酒酵母生長緩慢，在48 h 后才進(jìn)入平穩(wěn)期。此外，解脂耶氏酵母的細(xì)胞OD600值可達(dá)6，而釀酒酵母的最大OD600值僅為解脂耶氏酵母的一半。

圖1 釀酒酵母和解脂耶氏酵母細(xì)胞的生長曲線Fig.1 Cell growth curve of Saccharomyces cerevisiae and Yarrowia lipolytica

2.2 釀酒酵母對不同酚酸的耐受性

由圖2 可知：5.00 mmol/L 對羥基苯丙酸和咖啡酸處理的OD600值與對照相比無顯著差異，表明釀酒酵母可以耐受該濃度的對羥基苯丙酸和咖啡酸；5.00 mmol/L 對香豆酸可顯著影響釀酒酵母生長，表明其對釀酒酵母有毒性；隨著阿魏酸濃度的增大，釀酒酵母的OD600值減小，0.25 mmol/L阿魏酸即可顯著影響釀酒酵母生長，當(dāng)阿魏酸濃度為5.00 mmol/L 時(shí)，最大OD600值為1.5，而對照的最大OD600值為5.0，表明釀酒酵母不能耐受濃度為5.00 mmol/L 的阿魏酸；0.50 mmol/L 肉桂酸即可顯著影響釀酒酵母生長，當(dāng)肉桂酸濃度為5.00 mmol/L 時(shí)，釀酒酵母已經(jīng)完全不能生長。結(jié)果表明釀酒酵母對不同酚酸的耐受性表現(xiàn)為對羥基苯丙酸=咖啡酸＞對香豆酸＞阿魏酸＞肉桂酸。

圖2 釀酒酵母對不同酚酸的耐受性Fig.2 Tolerance of S.cerevisiae to different phenolic acids

2.3 解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性

由圖3 可知：5.00 mmol/L 對羥基苯丙酸和咖啡酸處理的OD600值與對照相比無顯著差異，表明解脂耶氏酵母可以耐受該濃度的對羥基苯丙酸和咖啡酸；5.00 mmol/L 對香豆酸對解脂耶氏生長有顯著的影響，該濃度下最大OD600值為4，而對照的最大OD600值為6，表明5.00 mmol/L 對香豆酸的毒性較小；5.00 mmol/L 的阿魏酸和肉桂酸均可顯著影響解脂耶氏酵母生長，且該濃度下，阿魏酸和肉桂酸處理的最大OD600值均為2，而對照的OD600值均為6，表明解脂耶氏酵母不能耐受濃度為5.00 mmol/L 的阿魏酸和肉桂酸；此外，0.25 mmol/L 肉桂酸、1.50 mmol/L 阿魏酸即可顯著影響解脂耶氏酵母生長。結(jié)果表明解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性表現(xiàn)為對羥基苯丙酸=咖啡酸＞對香豆酸＞阿魏酸＞肉桂酸。

圖3 解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性Fig.3 Tolerance of Y.lipolytica to different phenolic acids

總體來看，解脂耶氏酵母對不同酚酸的總體耐受性大于釀酒酵母。如：0.25 mmol/L 阿魏酸可顯著影響釀酒酵母生長，而1.50 mmol/L 阿魏酸可顯著影響解脂耶氏酵母生長；2.50 mmol/L肉桂酸可完全抑制釀酒酵母生長，而解脂耶氏酵母在5.00 mmol/L 肉桂酸處理下仍可生長，可見，解脂耶氏酵母更適合生產(chǎn)肉桂酸衍生化合物。

3 討論

目前，已有很多利用微生物進(jìn)行天然產(chǎn)物異源生產(chǎn)的研究。常用的異源表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母和枯草芽孢桿菌，但由于原核表達(dá)系統(tǒng)缺少翻譯后加工過程，使得異源表達(dá)的酶活性受到一定的影響，因此，酵母作為真核生物得到了廣泛的研究和應(yīng)用[22-23]。國外已有研究通過一系列代謝工程策略從釀酒酵母中產(chǎn)生25 g/L 青蒿酸，這是合成生物學(xué)領(lǐng)域的開創(chuàng)性成果[24]；國內(nèi)研究人員也在人參皂苷異源生產(chǎn)中通過改造酵母菌株生產(chǎn)出5.74 g/L 人參皂苷CK[25]。但是，與萜烯類和生物堿類天然產(chǎn)物相比，黃酮類化合物的擴(kuò)大培養(yǎng)效果不佳，在發(fā)酵罐中達(dá)不到理想的產(chǎn)量[26]。

前體小分子自身的毒性作用給黃酮類化合物的大量生產(chǎn)帶來困難。本研究通過分析酚酸類小分子對釀酒酵母和解脂耶氏酵母的毒性發(fā)現(xiàn)：2 種酵母對不同酚酸的耐受性有差異，解脂耶氏酵母對酚酸的總體耐受性大于釀酒酵母，且更適合生產(chǎn)肉桂酸衍生化合物，但2 種酵母對不同酚酸的耐受性基本一致。本研究中，解脂耶氏酵母對對香豆酸的耐受性研究結(jié)果與PALMER 等[27]的研究報(bào)道一致。已有報(bào)道沒有全面比較釀酒酵母和解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性研究，本研究通過比較這2 種酵母對不同酚酸的耐受性，為宿主的選擇提供了依據(jù)；同時(shí)可以利用耐受性的差異特性，通過更換不同的底盤酵母達(dá)到較高的生產(chǎn)水平，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本研究可以為解析酚酸類小分子抑制機(jī)制提供參考，也可為進(jìn)一步提高芳香氨基酸衍生物在酵母中的合成效率提供新思路。

4 結(jié)論

釀酒酵母和解脂耶氏酵母對不同酚酸的耐受性趨勢一致，均表現(xiàn)為對羥基苯丙酸=咖啡酸＞對香豆酸＞阿魏酸＞肉桂酸，且解脂耶氏酵母對酚酸的耐受性大于釀酒酵母。解脂耶氏酵母更適合用于生產(chǎn)芳香氨基酸衍生物，尤其是肉桂酸類衍生物的生物合成。